[发明专利]一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒，包含以下试剂：裂解液，PCR扩增试剂，阳性对照和阴性对照。

2.根据权利要求1所述直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒，其特征在于：所述裂解液含有2～4M异硫氰酸酯、7～10M乙二胺四乙酸、15～20M十二烷基肌氨酸和3～6％体积比的聚乙烯基吡咯烷酮；所述PCR扩增试剂含有5×PCR Buffer、2.0M dNTP、10pM正向引物、10pM反向引物、高保真Taq酶5U/μl、20mM MgCl₂和纯净水。

3.根据权利要求2所述直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒，其特征在于：所述正向引物为MPSF：GAAGCTATCAAAAAAGGGGAAACTA，所述反向引物为MPSR：TGTATCGGTTTCAGAAGAAG。

4.一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒的应用，包括以下步骤：

第一步、样品的采集，分为病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集为无菌条件下采集病料0.1mg～100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用，所述鼻咽拭子采集为采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；

第二步、样品裂解，取液体状样品10μl～100μl或研磨后的固体状样品0.1mg～100mg，加400～600μl裂解液，震荡混匀；

第三步、直接PCR反应，反应体系为25μl，取裂解后的样品5μl，加入PCR扩增试剂20μl，充分混合均匀后4000rpm离心10秒，阳性对照和阴性对照分别取5μl加入20μl PCR扩增试剂，PCR扩增程序为95℃3min；然后35个循环：94℃1min，55℃1min，72℃1min；最后72℃10min；

第四步、PCR产物的检测，取5μl扩增产物和2μl Loading Buffer混匀，加到含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，同时加入DNA Marker(DL 2000),电压为120V，电泳30min，然后在凝胶成像仪中观察结果。如果样品能扩增出600bp条带，说明样品为阳性，阳性对照也扩增出600bp条带，阴性对照没有条带。

5.根据权利要求4所述直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒的应用，其特征在于：所述第三步中的反应体系为25μl，裂解后的样品5μl，10pmol/μl的正向引物2μl，10pmol/μl的反向引物2μl，5×PCR Buffer 5μl，2.0mM/L dNTPs5μl，5U/μl的高保真Taq酶0.5μl，20mM MgCl₂ 3.5μl,纯净水2μl，充分混合均匀后短暂离心。

6.根据权利要求5所述用于猪支原体肺炎病原直接PCR检测的试剂盒的应用，其特征在于：扩增长度为600bp。

7.根据权利要求4所述直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒的应用，其特征在于：所述第四步中琼脂糖凝胶电泳时的凝胶浓度为1.0％，其中含有1％的凝胶燃料。