[发明专利]一种染色质免疫共沉淀样品快速制备方法

说明书

本发明公开了一种染色质免疫共沉淀样品快速制备方法，包括：对细胞进行甲醛交联，固定蛋白与核酸的复合物，将蛋白核酸复合物抽提出来，再将染色质片段通过超声或酶解打断成小片段；将抗体挂到固相支持物磁珠上，再将获得的小片段加到制好的磁珠上孵育，获得磁珠抗原抗体复合物，孵育完成后将未结合物质洗去，对磁珠抗原抗体复合物进行重悬，获得待检测的磁珠抗原抗体复合物样品。本发明方法操作简单，制备得到的磁珠复合物样品可直接用于PCR检测或者扩增，构建DNA文库，样品制备时间明显缩短，同时还避免了由于过多洗脱步骤造成的某些蛋白质与DNA富集信号较弱的缺陷，大大提高了检测的灵敏度，且对后续的PCR鉴定和DNA片段扩增不会产生任何不良影响。

技术领域

本发明属于染色质免疫共沉淀（ChIP）技术领域，更具体地，涉及染色质免疫共沉淀（ChIP）样品快速制备方法。

背景技术

组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多，二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质，有五种类型：H1、H2A、H2B、H3及H4组蛋白，它们富含带正电荷的碱性氨基酸，能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。

许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM）（即甲基化、乙酰化、泛素化和SUMO化）发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域确是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/或核小体改构复合体来实现。

组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括转录、异染色质的基因沉默和基因组稳定性。由于能影响到整个转录程序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。因此，组蛋白是如何被调节的以及如何影响PTM-特异性结合蛋白的相互作用将继续成为重大的研究领域。

特异性翻译后修饰的基因组定位研究现在常采用染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）的方法。染色质免疫共沉淀是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。

富含有特定翻译后修饰的基因组位点可以通过将含有感兴趣的标记的染色质片段进行免疫沉淀来确定，然后在对与该翻译后修饰相关的不同位点其所占的相对比例进行定量。

大多数染色质免疫共沉淀（ChIP）实验方案的第一步是用甲醛处理细胞，通过交联将染色质结合蛋白的位置固定。后生动物来源的细胞就可以直接进行裂解，而酵母细胞则必须先要进行细胞壁破碎，这可以通过机械力剪切或酶消化来完成。染色质可以以下列两种方式之一来切成下片段：通过超声打断来得到200~500bp长的片段，或用微球菌核酸酶消化成单核小体。然后，添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀结合复合体，再去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序。测序时，将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。