[发明专利]一种快速检测牛奶中支原体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛奶中微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测牛奶中支原体的方法。

背景技术

奶牛乳房炎是对世界奶牛业造成经济损失最大的疾病之一，随着人类对公共卫生的关注，乳房炎正日益引起专家学者、乃至普通人的关注。乳房炎作为重要的动物卫生疾病，给全世界的奶牛业造成了严重影响。乳房炎导致了产奶量的降低、质量的下降，使得抗生素的治疗成为必须，与之伴随的是要承受原奶供给被污染的风险，患乳房炎的奶牛其乳汁中经常含有大量的毒素、病原微生物以及治疗后残留的抗生素，食用这种牛奶后，能引起呕吐、腹泻、发热和过敏等症状，从而严重危及人类的健康；支原体是一类能在无活细胞培养基中繁殖的最小微生物，无细胞壁，繁殖形式多样，具有高度多形性。大部分支原体都是宿主特异性的黏膜常在菌，主要寄生在鼻腔，其次在乳腺，美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离出该病原。目前对牛奶支原体的分子鉴定主要是PCR技术，该技术虽然检测快速，但是仍然需要从牛奶中分离培养支原体，并且PCR扩增和检测需要特殊仪器，增加了检测的难度和成本，目前主要集中在实验室阶段。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测牛奶中支原体的方法，通过快速从牛奶中提取DNA，借助LAMP技术，建立从牛奶中快速检测支原体的核酸检测技术，极大的提高了检测效率，且检测成本低，为阻止支原体进一步扩散赢得了时间。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种快速检测牛奶中支原体的方法，步骤如下：(1)从奶牛场采集牛奶样，摇匀，取0.2ml放到1.5ml离心管中；(2)向奶样中加入0.8ml DNA提取裂解液，充分混合，静置5min，期间每间隔2min充分摇动一次；(3)继续向奶样中加入0.2ml脂肪分离液，充分摇匀，静置2min；(4)静置结束后，在10000r/min的转速下离心2min；(5)离心结束后，将上清液移到离心柱中，盖上盖，10000r/min离心2min后，弃去回收管及里面液体，将离心柱放于1.5ml的离心管中，向离心柱中加100uL蒸馏水，10000r/min离心1min；(6)在反应管中加入12.5uL支原体检测反应液，然后加入2uL步骤(5)处理后的奶样，最后加入10.5uL蒸馏水，充分混合；(7)将反应管放于63℃水浴锅中保温50min；(8)保温结束后，加入2uL支原体检测显色液，肉眼观察或借助紫外灯观察颜色变化，用肉眼观察时，溶液为黄色说明牛奶中存在支原体，橙色说明没有支原体；用紫外灯观察时，溶液为亮黄色说明牛奶中存在支原体，暗棕色说明没有支原体。

优选的，步骤(2)所述DNA提取裂解液的配制方法为：将57.3g盐酸胍和50ml水饱和酚混合，加蒸馏水配成总体积为100ml，混合均匀。

优选的，步骤(3)所述脂肪分离液是氯仿。

优选的，步骤(6)所述支原体检测反应液由以下物质组成：

其中，MgSO₄溶液中含有MgSO₄ 100mM，dNTP溶液中含dNTP10mM。

优选的，步骤(8)所述支原体检测显色液为SYBR Green。

(三)有益效果

本发明提供了一种快速检测牛奶中支原体的方法，通过快速从牛奶中提取DNA，减少了常规方法复杂耗时的步骤，借助LAMP技术，不需要使用特殊仪器，因此节约成本，降低检测难度，整个过程在1h内即可完成，极大的提高了检测效率，为治疗支原体感染疾病和阻止支原体进一步扩散赢得了时间。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

一种快速检测牛奶中支原体的方法，该方法用到的几种溶液如下所述：

DNA提取裂解液：将57.3g盐酸胍和50ml水饱和酚混合，加蒸馏水配成总体积为100ml，混合均匀。

脂肪分离液：氯仿

支原体检测反应液：由以下物质组成，