[发明专利]一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于工业中分离纤维素酶的方法，涉及一种从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素酶是地球上分布最广、最廉价、含量最丰富的多糖类物质，对人类而言，它同时又是自然界数量最大的可再生能源，它的降解是自然界碳循环的中心环节。纤维素酶能够通过水解作用将纤维素物质彻底降解，其水解产物能够进一步发酵生产乙醇、氢气及生产生物柴油的原料油脂等。因此，利用纤维素酶转化纤维素对于解决目前世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。目前，纤维素酶已被广泛用于洗涤剂工业、麻棉混纺织物后整理工业、食品工业、饲料工业、水产养殖行业，而且取得了良好的效果。

生产纤维素酶的微生物多种多样，有细菌、真菌、放线菌等，目前基本上均为陆生微生物，用陆生微生物生产的纤维素酶，其稳定性和环境耐受性一般都不是特别理想，而纤维素植物的降解一般均需要在粗犷的条件下进行，其纤维素降解效率常受到限制。海洋微生物由于其环境所致，具有不同于陆生微生物的独特技能。海洋寡养、高盐的独特环境为孕育出显著不同于陆生微生物特性的微生物提供了一个特殊的环境。生活在寡养环境的微生物往往具有降解大分子物质成为自身可利用的营养物质的酶系，纤维素酶的降解为可利用的糖类是寡养环境里的微生物采用的有限获取营养的主要方式。

纤维素酶的制取方法有两种：液体发酵和固体发酵，固体发酵具有液体发酵没有的优势，菌丝能有效附着在固体发酵基质表面，提高发酵效率、比酶活高，设备单位体积生产能力高，因此固体发酵成为发酵生产工业化的一个重要方向。

从发酵液中分离提取纤维素酶的工业级制备方面，柱层析分离方式由于高成本与操作的复杂性等原因很难有效的放大到工业规模。目前，工业中纤维素酶的分离方法主要有硫酸铵盐析和乙醇沉淀等。但是硫酸铵盐析后会产生大量的盐较难除去与回收，而乙醇沉淀的成本又相对较高，从而制约了木质纤维素原料及纤维素酶的大规模工业化应用。

发明内容

本发明的目的在于针对一般提取纤维素酶方法的弊端,提供一种从微生物海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法,本发明采用改进的单宁沉淀法分离提取经产纤维素酶微生物发酵产生的纤维素酶,并采用真空冷冻干燥法制备成粉末状纤维素酶产品,使纤维素酶的回收率能够达到90-95％,具有用时短，能耗小，操作简单，纤维素酶收率高的优点,克服了分离提取 纤维素酶阶段在整个木质纤维素制乙醇工艺中成本过高！操作复杂等难题,适用于纤维素酶工业化大规模制备。

本发明从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法通过以下步骤实现：

1、发酵液澄清：将海洋微生物固态发酵7-8天后生产的固态发酵液进行过滤、离心，得到发酵澄清液；所述的海洋微生物为海洋黑曲霉菌，Aspergillus sp.ZJUBE2010,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO.M2010132，保藏日期：2010年6月2日；

2、单宁沉淀：将上述发酵澄清液加入搅拌罐中,以一定的转搅拌一定时间,将一定量的单宁溶液加入搅拌罐中的发酵澄清液中,并持续搅拌一定时间,然后静置1-2h，进行纤维素酶的沉淀；

3、沉淀收集：将经过单宁沉淀的发酵液以一定的进行离心，上清液去掉，收集沉淀；

4、沉淀复溶：将上述沉淀用一定体积的浓度为20mg/ml的聚乙二醇溶液复溶，并持续搅拌一定时间，然后静置1-2h，进行复溶；

5、产品收集：将上述溶液，置于离心机中以一定的转速离心一段时间，上清液即为浓缩之后的纤维素酶液，将浓缩液置于真空冷冻干燥机中干燥制得粉末状纤维素酶产品。

所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中,对步骤1中得到的所述发酵澄清液和步骤4中经单宁沉淀聚乙二醇解析之后收集到的纤维素酶液分别用滤纸酶活力测定方法测定其纤维素酶活力。

所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤2中单宁的用量按照10g/L的用量向发酵澄清液中添加。

所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中步骤2和步骤4中，搅拌的转速为80r/min,搅拌时间为10min。

所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤3和步骤5中，离心的转速为4000r/min，离心时间为20min。

所述的从海洋黑曲霉发酵液中回收纤维素酶的方法中，步骤4中，聚乙二醇溶液的浓度为20g/L，溶质为分子量为6000的PEG，溶剂为自然水。