[发明专利]一种草鱼出血病毒的检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对。本发明还公开了一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法。本发明还公开了一种草鱼出血病毒的检测试剂盒以及检测方法。本发明建立的一步法荧光定量RT‑PCR方法与已报道的方法相比，不仅简单、快速，而且准确、灵敏、检出限低。该方法能快速、准确测定患病鱼体组织中的病毒及含量。

技术领域

本发明涉及鱼类致病病毒的检测领域，涉及一种鱼类致病病毒检测试剂盒以及检测方法，尤其涉及一种草鱼出血病毒的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

草鱼出血病毒(grass carp hemorrhage virus,GCHV，国际病毒分类委员会称之为reovirus of grass carp,GCRV)是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70～80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了10个分离株，该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。

草鱼病毒性出血常发生在每年4－10月，当水温在15℃以下病情逐渐消失。其主要症状是充血，病鱼口腔、鳃盖、鳍基、肠道、肝、脾等器官出血现象，严重时全身肌肉呈鲜红色，鳃失去鲜红呈苍白色，但肠道、肌肉无腐烂、水肿现象出现。

为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内是否存在该致病病毒的技术。荧光定量聚合酶链反应(Real-time Fluorescent QuantitativePolymerase Chain Reaction,RtFQ-PCR)因其具有简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在病原检测领域得到了广泛应用。

目前对于草鱼出血病毒的检测国内尚没有相关的定量PCR检测技术方面的研究报告。草鱼出血病毒是一种RNA病毒，普通的检测过程复杂，RNA易降解，导致假阴性出现。

发明内容

发明目的：本发明的所要解决的技术问题是提供用于荧光定量基因扩增法快速检测GCHV-strain 873毒株的VP5基因序列(AF239175.1)引物及其应用，从分子水平对草鱼出血病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种草鱼出血病毒荧光定量一步法检测试剂盒，根据Genbank公布的GCHV-strain 873毒株的VP5基因序列(AF239175.1)，设计特异性引物，利用荧光定量RT-PCR扩增靶基因的特定区域，从分子水平上对草鱼出血病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种一步法荧光定量检测试剂盒检测草鱼出血病毒的方法，能检测GCHV感染的病鱼组织和细胞等。

技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对，所述引物对包括上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R，所述上游引物VP5-Ⅱ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物VP5-Ⅱ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

上游引物VP5-Ⅱ-F：5’-CTCCGTGTTGACCCTGGATGTG-3'；

下游引物VP5-Ⅱ-R：5’-ATGTTAGCAGCGGTAGTGACTTGTTG-3'。

一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法，包括以下步骤：

1)生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到所述的引物对；

2)草鱼出血病毒VP5基因的荧光定量PCR检测：用病毒RNA提取试剂盒提取获得草鱼出血病毒基因组RNA样本；