[发明专利]一种草鱼出血病毒的检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R，所述上游引物VP5-Ⅱ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物VP5-Ⅱ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如权利要求1所述的引物对；

2）草鱼出血病毒VP5基因的荧光定量PCR检测：用病毒RNA提取试剂盒提取草鱼出血病毒基因组RNA；

3）以步骤2）的草鱼出血病毒基因组RNA样本为模板，将权利要求1所述的引物对进行一步法荧光定量RT-PCR获得PCR扩增产物；

4）步骤3）得到的PCR扩增产物分析并测序获得草鱼出血病毒VP5基因序列。

3.根据权利要求2所述的一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法，其特征在于，所述步骤1）是通过荧光定量RT-PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到权利要求1所述的引物对。

4.一种草鱼出血病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述草鱼出血病毒的检测试剂盒包括权利要求1所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的草鱼出血病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1.5：1。

6.根据权利要求4所述的草鱼出血病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：

1）草鱼出血病毒反应液、Taq DNA聚合酶和反转录酶：草鱼出血病毒反应液包括含有dNTPs、10×buffer、MgC1₂、SYBR green I、DEPC水及权利要求1所述的引物对的混合液；

2）阳性对照物：

3）临界阳性对照物；

4）阴性对照物。

7.根据权利要求4所述的草鱼出血病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物是含有高纯度草鱼出血病毒提取的总RNA。

8.权利要求4~7任一项所述的草鱼出血病毒的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。

9.权利要求4~7任一项所述的草鱼出血病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法是将RNA反转录和荧光定量PCR反应在同一个反应管内连续进行。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：

1）提取鱼样组织的RNA得到样品RNA；

2）建立一步法荧光定量RT-PCR反应体系；

3）通过比对标准品实时荧光定量RT-PCR扩增曲线确定是否感染草鱼出血病毒。