[发明专利]鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法

权利要求书

1.一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记的分子探针组合，其特征在于，所述分子探针组合为分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记的分子探针组合，其特征在于，所述分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。

3.一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备黑麦染色体标本：

步骤2、制备分子探针、工作液和杂交液：

步骤3、原位杂交：

步骤4、比对；

所述步骤2中的制备分子探针、工作液和杂交液具体为：

所述分子探针用由生物公司利用5’末端FAM荧光标记法合成寡核苷酸序列，具体为分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，纯化后用1xTE、pH8.0的Tris-EDTA缓冲液溶解，利于探针长期保存；使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合；所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示；

工作液是通过4SSc和2xTE的1:1混合，最终浓度为2SSC 1xTE，pH7.0；-20℃保存备用；

杂交液为2SSC 1xTE，pH7.0的溶液。

4.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤1中的制备黑麦染色体标本具体为：

步骤1.1、将种子放于浸润了双蒸水的培养皿中，放于恒温于22-24℃的培养箱中培养；待种子萌动后，放置于4℃冰箱内，使种子萌发同步，24小时后将种子上发芽梳，在22-24℃培养箱中培养；培养至种子根长至1-2cm时，剪根；

步骤1.2、将剪下的根放在喷了蒸馏水的0.5ml离心管中，离心管的盖子上戳一透气孔，一氧化二氮处理2小时；

步骤1.3、用体积浓度为90％的醋酸固定8分钟，蒸馏水清洗3次或者加入70％酒精放-20℃保存；

步骤1.4、用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入酶中，37℃水浴1小时；

步骤1.5、用体积分数为70％的酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，于2000转/分的转速下离心10秒，尽量将酒精倒干，加100％乙酸，每个根尖20μl，用移液枪反复吸打混匀；

步骤1.6、将载玻片放在湿润的盒子里，每片滴7μl细胞悬液，盖上盒盖，5分钟后镜检，制备得到制备黑麦染色体标本。

5.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤3中的原位杂交具体为：

步骤3.1、将合成的探针各0.3ul加入8.0ul的2XSSC 1xTE、pH7.0的杂交液之中；每张玻片加杂交液后，轻轻盖上盖玻片，在37℃湿盒中，杂交3小时以上或过夜；

步骤3.2、将杂交的玻片取出，立即放在2xSSc溶液工作液中，盖玻片会自动脱落；浸泡2分钟；取出玻片用洗耳球吹干；

步骤3.3、加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，即在荧光显微镜下观察照相。

6.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤4中的比对具体为：利用荧光显微镜，通过载玻片上野生和栽培黑麦的染色体标本，在480nm至500nm波长的荧光激发下，以蓝色荧光为背景，观察野生黑麦染色体端部，具有4-20个绿色的荧光信号的为野生黑麦，具有2个以下绿色的荧光信号的为栽培黑麦。