[发明专利]一种羰基还原酶、突变体及其在制备他汀合成中间体中的应用

说明书

本发明涉及一种来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.3258的羰基还原酶及其活性提高的突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化不对称还原制备手性羟基化合物的应用，特别是阿托伐他汀手性中间体6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成方面的应用。与不对称还原制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯的其他方法相比，本发明具有底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，因此在阿托伐他汀手性侧链的工业化生产中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC 1.3258的羰基还原酶及其活性提高的突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化不对称还原制备手性羟基化合物的应用，特别是阿托伐他汀手性中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成方面的应用。

背景技术

阿托伐他汀是他汀类药物的一种，主要用于治疗高胆固醇血症和冠心病，反应机理是通过竞争性抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，降低低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯的水平。辉瑞公司开发的药物“立普妥”(其活性成分为阿托伐他汀)年销售额曾超过100亿美元，是历史上最畅销的药物。6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀原料药的重要手性中间体，其包含两个手性中心，但是只有一种构型是有活性的，即两个手性羟基都处在顺式位，构型为syn-(3R,5R)。阿托伐他汀原料药合成中对该手性侧链立体构型的要求为：ee>99.5％，de>99％，因此该手性侧链的合成具有一定的挑战性。目前可通过化学法和生物催化法合成该手性侧链。

传统化学法生产6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的反应条件苛刻，反应过程需要在低温(-85℃～-100℃)下进行，而且需要添加甲氧基二乙基硼烷(或三乙基硼烷)作为手性诱导剂，采用硼氢化钠作为还原剂，溶剂为甲醇和四氢呋喃(US 5155251)。该工艺可以制得较高光学纯度(de 98％)的中间体，通过重结晶可将非对映异构体纯度提高到>99％(de)，但是该工艺能耗高，需要使用大量有毒的有机溶剂，并且产生大量废弃物，不符合绿色化学的要求。