[发明专利]一种丙谷二肽的制备方法

说明书

本发明涉及一种丙谷二肽的制备方法，利用大肠杆菌分别表达来自于枯草芽孢杆菌的氨基酸连接酶和来自于丙酮丁醇梭菌的乙酸激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。氨基酸连接酶催化L‑丙氨酸和L‑谷氨酰胺生成丙谷二肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，乙酸激酶则催化乙酰磷酸和ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生。利用上述双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应8h可以得到32.5mM的丙谷二肽，摩尔转化率为64.5％。本发明提供的丙谷二肽生产方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点，具有较好的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及核苷类产品生物技术生产领域，尤其是一种丙谷二肽的制备方法。

背景技术

L-谷氨酰胺作为一种人体代谢所必需氨基酸，其在体内转变成为糖胺，作为合成粘蛋白的前体，可促进溃疡愈合，作为肠外营养药品应用于严重感染、复合性骨折、创伤、大手术、大面积烧伤，化学毒物伤害、辐射伤害、有害物伤害病人的治疗和恢复；还可用作脑功能改善剂，用于改善智力发育不良儿童和精神障碍、酒精中毒、癫痫病人脑功能；此外，它还可以作为免疫缺乏综合征如艾滋病、危重病或骨髓移植后伴发的免疫功能低下的治疗药物，因而广泛应用于医疗行业。由于L-谷氨酰胺对酸敏感，加热时易产生有毒的焦谷氨酸和氨，水溶性差(35g/L，20℃)，长期储存时化学稳定性不足等化学性质大大限制了其在临床上的应用。为了解决L-谷氨酰胺的这些缺陷，研究人员做了一系列的研究，其中一种方法就是通过与其它氨基酸连接形成二肽，作为L-谷氨酰胺的替代品应用于临床。在这些二肽中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(简称丙谷二肽)的水溶性和热稳定性均优于L-谷氨酰胺与其它氨基酸形成的二肽，是国际公认的L-谷氨酰胺的最适载体。

丙谷二肽是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺缩合形成的二肽，属于氨基酸类的化学药剂，由德国费森尤斯(Fresenius AG)于1995年研发成功，首先在德国批准上市，1999年作为进口药物进入中国市场。目前，工业生产丙谷二肽的方法主要为化学法(ZL201210371136.4；ZL201210382194.7；ZL201310169606.3；ZL 201310700449.4)。近年来，已有报道采用氨基酸酯酰基转移酶催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺生成丙谷二肽(201410663050.8；201410670694.X；201510064439.5)，但由于原料L-丙氨酸甲酯盐酸盐合成工艺复杂，导致该方法的生产成本较高，不利于工业化放大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种低成本的丙谷二肽的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种丙谷二肽的制备方法，以L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、ADP和乙酰磷酸为原料(底物)，加入氨基酸连接酶和乙酸激酶，在pH 6.5-9.5、32-42℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成丙谷二肽。

优选的，上述丙谷二肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)分别构建氨基酸连接酶的基因重组表达载体pET-His-ywfE和乙酸激酶的基因重组表达载体pET-His-ack，其中，所述氨基酸连接酶编码基因来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ATCC 15245)，其核苷酸序列为序列表4001所示序列；乙酸激酶编码基因来源于丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum(ATCC 4259)，其核苷酸序列为序列表4002所示序列，质粒pET-His的核苷酸序列为序列表4003所示序列；

(2)分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(ACCC11171),获得基因工程重组菌株E.coli pET-His-ywfE和E.coli pET-His-ack；

(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达氨基酸连接酶和乙酸激酶的菌体；