[发明专利]一种丙谷二肽的制备方法

权利要求书

1.一种丙谷二肽的制备方法，其特征在于：以L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、ADP和乙酰磷酸为原料，加入氨基酸连接酶和乙酸激酶，通过酶促反应偶联催化合成丙谷二肽,具体步骤如下：

（1）分别构建氨基酸连接酶的基因重组表达载体pET-His-ywfE和乙酸激酶的基因重组表达载体pET-His-ack，其中，所述氨基酸连接酶编码基因来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其核苷酸序列为序列表4001所示序列；乙酸激酶编码基因来源于丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum，其核苷酸序列为序列表4002所示序列，质粒pET-His的核苷酸序列为序列表4003所示序列；

（2）分别将步骤（1）中的重组表达载体转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,获得基因工程重组菌株E.coli pET-His-ywfE和E.coli pET-His-ack；

（3）培养步骤（2）中的重组菌株，从而获得表达氨基酸连接酶和乙酸激酶的菌体；

（4）破碎步骤（3）中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；

（5）将步骤（4）中获得的混合酶液加入含有30-60 mM L-丙氨酸、30-60 mM L-谷氨酰胺、3.0-6.0 mM ADP和30-60 mM乙酰磷酸的催化液中，在pH值为8.0-9.0，温度为32-42 ℃条件下进行酶促反应合成丙谷二肽。

2. 根据权利要求1所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中重组菌株中的培养方法为：重组菌株从甘油保菌管中以0.1%（v/v）的接种量接种至100 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，于37 ℃ 200 rpm培养12 h，再按1%（v/v）接种量转接400 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，于37 ℃ 200 rpm继续培养；待菌株浓度OD_600nm达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3 mmol/L的IPTG，28 ℃诱导培养8-10 h表达蛋白。

3.根据权利要求2所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：所述LB液体培养基为：每10 g NaCl与5 g酵母粉、10 g蛋白胨用去离子水定容到1 L。

4.根据权利要求1所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：所述催化液为浓度50 mM的PBS缓冲液中含有L-丙氨酸、L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的浓度均为50 mM，ADP的浓度为5mM。