[发明专利]一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法

权利要求书

1.一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法的灵敏度指标最低检测限为0.5ng/mL，包括以下步骤：

步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，具体步骤如下：

a）将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；

b）向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体；所述黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’；

c）将步骤b）激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a）的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；

d）将步骤c）的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体混合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针，并在4℃保存；

步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；

步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；

步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；

步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。

2.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。

3.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，吐温-20；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05%。

4.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na₂HPO₄，2mmol/L的KH₂PO₄，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1%。

5.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述胶体金中金颗粒的直径为20nm。

6.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH为5.0。

7.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述蔗糖酶浓度为2mg/ml。