[发明专利]一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术系统是由一种来自链球菌的Cas9核酸酶、一个序列恒定的tracrRNA(trans activating crRNA)和一个与靶基因特异性互补的20nt crRNA组成。与ZFNs和TALENs技术不同的是CRISPR/Cas9技术对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶位点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，对于需要定点编辑的靶基因更容易找到合适的靶位点。而且由于该技术只需要针对靶基因设计一段特异性的crRNA序列，即可快捷地实现基因的定点敲除。这一技术不仅彻底改变了传统基因组定点编辑技术的概念，并在短短两年内被成功应用于对多种生物的基因组进行走点敲除、敲入或者突变。

sgRNA分子由间隔序列(spacer)和trancrRNA两段序列构成：(1)间隔序列长度为20nt，与基因的靶位点互补，它位于PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列(NGG)的5’端，需要根据靶基因序列单独设计；(2)tracrRNA序列恒定，能结合并激活Cas9蛋白质。在spacer的引导下，sgRNA将活化的Cas9蛋白带至基因的靶位点，在PAM序列上游3-8个碱基间将靶基因的DNA双链切断，形成钝性末端的断裂。

在CRISPR/Cas9技术发明以前，细菌的基因敲除主要依靠基于同源重组技术。这种技术存在效率低下，操作过程复杂，需要耗费长的时间筛选阳性克隆等缺点。研究表明，与上述同源重组技术相比，CRISPR/Cas9技术具有以下有点：(1)效率高，CRISPR/Cas9技术敲除目的基因是同源重组技术的1000倍；(2)可采用同一个CRISPR/Cas9载体同时或先后对多个靶点进行敲除；(3)操作简便，只需要根据靶基因设计一条或者两条sgRNA，并将sgRNA的编码DNA克隆入载体，然后转化细菌即可实现基因敲除。

然而，由于绝大部分细菌不具备自主的非同源末端链接系统，Cas9蛋白切割细菌基因组DNA造成的DSB将直接导致细菌死亡，基因敲除操作也随之失败。因此，现有技术中，为避免细菌死亡，需要同时向细菌内导入与靶序列具有高度同源性的线性双链DNA，从而增加了操作步骤和费用。由于构建同源线性双链DNA需要经过多次PCR并连接PCR产物，进一步增加了操作步骤和费用。因此，现有技术的CRISPR/Cas9系统存在操作繁琐、操作难度大、基因敲除效率仍然不够高的缺点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用基因敲除技术构建细菌缺陷株的试剂盒及方法。

本发明根据CRISPR/Cas9技术原理和NHEJ(Non-homologous End Joining)修复机制进行设计，形成含有sgRNA筛选系统和NHEJ修复系统的pCAG-NHEJ载体的试剂A。

首先，本发明中sgRNA筛选系统和NHEJ修复系统的pCAG-NHEJ载体的构建，采用基础质粒pBBRlMCS-2(本领域常规质粒)，使用BamHI和XbaI双酶切线性化和CIAP碱性磷酸酶去磷酸化。人工合成J23119(SpeI)-sgRNA，与线性化的pBBRlMCS-2进行连接反应，经热激转化大肠杆菌后涂布平板，挑取单克隆，测序确定序列完全正确，获得pBBRlMCS-2-sgRNA质粒。再经BamHI和HindIII双酶切线性化和CIAP碱性磷酸酶去磷酸化，分别人工合成J23119-Cas9-J23119-ligD-J23119-mKu基因全长CDS,与BamHI和HindIII双酶切线性化的pBBRlMCS-2-sgRNA进行连接反应。经热激转化大肠杆菌后涂布平板，挑取单克隆，测序确定序列完全正确，获得pCAG-NHEJ(SEQ ID NO:1)质粒。在后续sgRNA筛选系统使用过程中可替换针对不同靶基因DNA的sgRNA，获得针对不同靶基因DNA的pCAG-NHEJ质粒。

其次，CaCl₂法可用于制备大多数革兰氏阴性菌感受态。

最后，通过质粒转化，进行抗性筛选并验证sgRNA对目的基因DNA敲除作用的有效性，从而获得细菌敲除株。

本发明的有益效果是：本试剂盒和方法采用CRISPR/Cas9技术原理和NHEJ修复机制进行设计，形成可以高效进行sgRNA筛选系统的试剂，该方法操作简单、快速，可有效缩短实验周期和成本。

附图说明

图1为pCAG-NHEJ质粒图谱；