[发明专利]一种制备L-苹果酸的方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种制备L‑苹果酸的方法，其包括如下步骤：按照混合种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例将混合种子液转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/L，继续发酵3d，停止发酵，得到苹果酸发酵液。本发明方法L‑苹果酸产量和糖酸转化效率高，可规模化生产。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种制备L-苹果酸的方法。

背景技术

苹果酸,又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸,分子式为C₄H₆O₅，分子量134.09，结构式为HOOCCHOHCH₂COOH。苹果酸具有右旋（D-型）和左旋（L-型）两种旋光异构体及DL-型外消旋体三种型式产品。其中L-苹果酸，广泛存在于生物体中，作为三羧酸循环的一员参与细胞代谢；D-苹果酸人体不易代谢，吸入或吞咽其对人体有害，作为手性合成的手性源，可以合成许多重要的有机化合物。

L-苹果酸的生产最初是在培养黄曲霉时有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。后来，由糖类物质发酵来生产L-苹果酸，但是传统的发酵法生产L-苹果酸培养时间长、能耗大、产酸率低，糖的利用率不高，很难实现工业化生产。随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术L-苹果酸也有了长足的进步，但是L-苹果酸的工业平均转化率为70%-80%，尚有20%-30%富马酸残留，反应液中L-苹果酸的含量较低，大约为100g/L左右，目前国内尚无规模化的L-苹果酸生产方法。申请人之前的发明专利“一种直接发酵法生产L-苹果酸的方法”以及“一种L-苹果酸提取新工艺”通过优化工艺以及菌株合理配伍，大幅度提高了苹果酸的产量以及糖酸转化率，但是黄曲霉会产生一定量的黄曲霉素，产品中会残留黄曲霉毒素，后续分离步骤繁琐，增加了企业成本。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种制备L-苹果酸的方法。

本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：

一种制备L-苹果酸的方法，其包括如下步骤：

按照混合种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例将混合种子液转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/L，继续发酵3d，停止发酵，得到苹果酸发酵液。

具体地，所述混合种子液按照如下工艺制备而得：

1）将米曲霉菌液按照8％的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到种子液A；所述种子罐的培养基组分为：蔗糖3g/L，硝酸钠0.2 g/L，硫酸铵0.5 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，磷酸氢二钾0.1 g/L，一水硫酸锰0.1 g/L，七水硫酸亚铁0.01 g/L，硫酸镁0.01 g/L，氯化钠0.01 g/L，pH值6.0；

2）将寄生曲霉菌液按照6％的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为32℃，摇床转速为200r/min，培养24小时得到种子液B；所述种子罐的培养基组分为：木糖10 g/L，硫酸铵0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，磷酸氢二钾0.1 g/L，一水硫酸锰0.1 g/L，七水硫酸亚铁0.01 g/L，硫酸镁0.01 g/L，pH值6.5；

3）将种子液A和种子液B按照2:1的体积比混匀得到混合种子液。

优选地，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，pH值6.2。

优选地，所述米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae) ACCC 30584，所述寄生曲霉为寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)CICC 40365。