[发明专利]一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，尤其是一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌，被广泛添加于饲料中。

目前，杆菌肽通过微生物发酵法生产，主要生产菌株为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。杆菌肽发酵过程中具有强烈的臭味，严重影响环境，且异味物质附着在杆菌肽产品表面，影响产品质量。鉴于现有的大多数地衣芽胞杆菌生产杆菌肽的产量均较低，不利于投入工业化生产，因此，现有的关于杆菌肽的研究都集中在提高杆菌肽产量以追求经济效益的最大化，而并未见到关于解决如何去除杆菌肽发酵生产中臭味的相关研究。

在微生物发酵过程中，通常采用的除臭方式为：采用除臭剂对发酵过程中的臭味气体进行吸附去除。但是，这种除臭方式不仅需要大量的除臭剂，增加了投入成本，并且，除臭剂需要放置于发酵罐内，容易造成发酵液染菌，造成重大经济损失。随着人们对环境安全和产品品质的日益关注，杆菌肽发酵异味问题亟待解决。

发明内容

本发明旨在提供一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法，将此菌株应用在杆菌肽生产中，可实现高产杆菌肽的同时显著减小发酵异味的目的。

一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：

1)根据地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2基因组DNA序列中的ptb基因的上、下游序列，设计ptb基因的上、下游同源臂引物；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ptb基因的上、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂，再利用重叠延伸PCR方法将ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamH I对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；同时，采用限制性内切酶XbaⅠ和BamH I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori，并将酶切基因序列A连接到酶切质粒T2(2)-ori中，得到ptb基因敲除质粒T2(2)-ori-ptb；

3)通过电转化将步骤2)得到的ptb基因敲除质粒T2(2)-ori-ptb转入地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ptb基因的上游臂或ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

4)挑选ptb基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ptb基因的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2△ptb；

其中，步骤(1)和步骤(3)中所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ptb基因为SEQUENCE LISTING中所示。