[发明专利]在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除的方法

说明书

本发明提供一种在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除方法，采用聚合酶链式反应或全基因合成的方法获得目标敲除基因上下游序列后，将上下游序列按与原基因相反方向连接，并插入到载体质粒上构建环状克隆载体，对环状克隆载体进行线性化处理得到线型双链DNA，将线型双链DNA经由5’→3’核酸外切酶处理，形成线型3’突出长粘端双链DNA后转化灰盖鬼伞细胞。本发明借助特殊的外源DNA结构类型，在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除。定点基因敲除准确率可达到25～70％，能够大幅减少灰盖鬼伞定点基因敲除工作量，在灰盖鬼伞功能基因研究及基因工程菌株构建等方面具有较大应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程领域，主要是涉及一种灰盖鬼伞高准确率定点基因敲除方法。

背景技术

灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)属担子菌亚门鬼伞科鬼伞属真菌，全基因组序列已知，是大型丝状真菌模式生物。以英国皇家科学院院士Lorna教授为代表的研究群体，基于灰盖鬼伞开展了大量有关丝状真菌性别识别、发育机理和外源基因表达研究工作。灰盖鬼伞定点基因敲除是指将外源DNA导入灰盖鬼伞靶向敲除或失活某些功能基因的研究。目前灰盖鬼伞定点基因敲除效率很低，一般在5％左右。多年来，低下的定点基因敲除效率，严重滞缓了灰盖鬼伞功能基因组研究。同时这一低基因同源重组现象在其他大型真菌(主要指大型食药用担子菌)中也普遍存在，这导致获得大型真菌基因敲除菌株难度较高，进而对相关功能基因研究产生极大的不利影响。

定点基因敲除是基因同源重组的结果，而外源DNA介导基因同源重组的效率与其拓扑结构关系密切。大量研究工作已经证实，在小型丝状真菌中(如曲霉中)，线型外源dsDNA定点基因敲除准确率普遍高于超螺旋dsDNA，这说明DNA拓扑结构与其定点基因敲除活性间的直接相关性，是已经获得公认的科学事实。目前在进行灰盖鬼伞定点基因敲除时，通常采用环状或超螺旋质粒DNA、或线型双链DNA作为外源DNA，其两个末端可为平端、短5’突出粘端(常见为4bp突出粘端)、或短3’突出粘端(常见为4bp突出粘端)。由于通常细胞中非同源重组效率远高于同源重组，因此在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除并非易事。因此，如能建立新的高效方法，将定点基因敲除准确率提高到50％以上，则针对每个克隆试验随机挑选2-3个转化子即可有效获得目标基因克隆，筛选工作量将大幅降低。本发明针对高准确率定点基因敲除问题，公开一种新型DNA结构及其介导的高准确率灰盖鬼伞定点基因敲除方法。该方法可有效提高灰盖鬼伞定点基因敲除准确率，为灰盖鬼伞遗传学研究、功能基因研究及基因工程菌株培育提供高效技术手段，同时为其他大型食用菌基因敲除研究提供参考。本发明设计关键创新点-“线型3’突出长粘端双链DNA”结构及其应用尚未见报道

发明内容

本发明的目的是提供一种在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除的技术方法。灰盖鬼伞定点基因敲除基于基因同源重组原理，通过外源DNA在基因组中的定点插入实现定点基因敲除。在定点基因敲除过程中，外源DNA的3’单链末端对目标DNA区段的入侵是实现同源基因克隆的分子基础。当以平端或短粘端线型双链DNA为外源DNA时，进入细胞后需经胞内核酸酶处理形成3’端长单链末端，然后发生单链入侵，进而实现基因同源重组。由于外源DNA在细胞内形成3’端长单链末端的效率低下，导致定点基因敲除效率低下，进而导致定点基因敲除准确率低下。本发明在体外制备了携带3’端长单链末端的外源DNA，即“线型3’突出长粘端双链DNA”，解决了细胞内形成携带3’端长单链末端效率低下的问题，从而实现了高准确率定点基因敲除，具体表现为灰盖鬼伞中的高准确率定点基因敲除。

在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶链式反应或全基因合成的方法获得目标敲除基因上下游序列后，将上下游序列按与原基因相反方向连接，并插入到载体质粒上构建环状克隆载体，对环状克隆载体进行线性化处理得到线型双链DNA，将线型双链DNA经由5’→3’核酸外切酶处理，形成线型3’突出长粘端双链DNA后转化灰盖鬼伞细胞。

进一步地，所述线型3’突出长粘端双链DNA两端各携带1段与目标敲除基因上游或下游序列相同的同源序列。