[发明专利]在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除的方法有效
| 申请号： | 201710017237.4 | 申请日： | 2017-01-11 |
| 公开（公告）号： | CN106947704B | 公开（公告）日： | 2020-07-24 |
| 发明（设计）人： | 柳永;刘士旺;鲍文娜 | 申请（专利权）人： | 浙江科技学院 |
| 主分类号： | C12N1/15 | 分类号： | C12N1/15;C12R1/645 |
| 代理公司： | 杭州天昊专利代理事务所(特殊普通合伙) 33283 | 代理人： | 向庆宁 |
| 地址： | 310023 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 灰盖鬼伞中 实现 准确率 定点 基因 方法 | ||
【权利要求书】：
1.在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶链式反应或全基因合成的方法获得目标敲除基因上下游序列后，将上下游序列按与原基因相反方向连接，并插入到载体质粒上构建环状克隆载体，对环状克隆载体进行线性化处理得到线型双链DNA，将线型双链DNA经由T5核酸外切酶处理，酶用量为400U/nmol线型双链DNA载体，处理温度55℃，处理时间为5min，经核酸酶处理后3’端单链粘端长度为300nt，形成线型3’突出长粘端双链DNA后转化灰盖鬼伞细胞，所述线型3’突出长粘端双链DNA两端各携带1段与目标敲除基因上游或下游序列相同的同源序列，其两个3’突出粘端的延伸方向均指向目标基因的编码区，即两个3’突出粘端相向而行共同指向目标敲除基因区段，所述同源序列的长度为500bp。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，线型3’突出长粘端双链DNA转化灰盖鬼伞细胞的方法是电击介导法、聚乙二醇介导法、氯化锂介导或醋酸锂介导法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，线型3’突出长粘端双链DNA转化灰盖鬼伞细胞的方法是原生质体介导法。
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