[发明专利]一种用于检测乳腺癌的引物组及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测乳腺癌的引物组及检测方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占到全身各种恶性肿瘤发病率的7％-10％。乳腺癌的全球发病率一直呈上升态势，每年约有100万多人被诊断为乳腺癌，约50万人死于乳腺癌，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的疾病。

乳腺癌有着复杂的实体生物学特性和临床表现。许多临床和病理特征已被做为预测疗效和预后，其中经典的包括：年龄，肿瘤大小，腋窝淋巴结受累情况，血管淋巴管浸润，组织学分级，雌激素受体状态，孕激素受体状态与HER-2/neu基因的表达。随着乳腺癌的早期诊断筛查得到普及，早诊断早治疗明显改善了乳腺癌患者的预后，提高了乳腺癌患者的生存率，延长了生存时间。但并非所有乳腺癌患者都有明显的获益，预后较差的三阴性乳腺癌患者以及复发转移患者都面临着治疗效果不理想，生存时间短的困境，成为乳腺癌基础研究和临床治疗面临的挑战之一。

目前乳腺癌的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括X射线、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。

近来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。

CTCs的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选方法通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获表面未表达肿瘤标记物的CTCs细胞。

采用RT-PCR方法检测CTCs细胞中特异性基因是CTCs细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。

目前采用RT-PCR方法检测卵巢癌CTCs的标准还没有完全建立。通过检测乳腺癌患者的CTCs特征基因，能够确定乳腺癌CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。

针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测PR、ER、EPCAM、HER2和MUC1等5个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测乳腺癌的引物组及检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测乳腺癌的引物组，包含：

本发明的引物组可通过以下两种方法实现乳腺癌的检测。

方法1：PCR方法。

(1)将权利要求1所述的5对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；

(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

方法2：荧光定量PCR方法