[发明专利]一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法

说明书

本发明提供了一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜‑结球甘蓝易位系的方法，包括：a)确定易位系中结球甘蓝的基因片段区段；获得所述结球甘蓝的基因片段区段及其侧翼区域所有基因序列以及大白菜中对应的共线性基因序列，并根据基因序列的差异位点设计覆盖差异位点区域的引物；b)利用上述引物对易位系亲本大白菜和亲本结球甘蓝进行PCR扩增，根据扩增结果确定结球甘蓝相对于大白菜特异的基因标记；c)利用上述基因标记对易位系亲本大白菜、亲本结球甘蓝和易位系自交后代进行PCR扩增，根据扩增结果获得易位系的鉴定结果。本发明基于大白菜和结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物，增加扩增效率的差异，可以直接鉴定外源基因的导入。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法。

背景技术

易位系是某物种(供体)的一段染色体和另一物种(受体)的相应染色体片段发生交换后形成的新类型，是作物改良育种的一种手段，可提高作物抗性，增加作物产量和提升作物品质，在作物育种方面具十分重要的意义。在目的基因导入易位系的过程中，对被转移的基因及其染色体片段在受体背景中进行追踪和鉴定，可以提高选择的准确性，缩短育种周期，提高育种效率。因此，对导入易位系中的外源染色体片段进行准确鉴定十分重要。

分子标记(Molecular markers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列(DNA)变异为基础的遗传标记，在基因型确定、遗传多样性分析、外源片段鉴定、标记辅助育种和系统发育分析等研究中是非常有价值的工具。目前用于鉴定易位系外源片段的方法主要是SSR标记(Simple sequence repeat marker)和InDel标记(Insert/delete marker)。但是由于SSR标记在大白菜和甘蓝间的多态性比率较低，无法用于鉴定大白菜遗传背景中外源甘蓝片段的导入，尽管InDel标记在大白菜-结球甘蓝易位系鉴定中表现了很大优势，但InDel标记无法鉴定具体导入的外源基因和片段在大白菜染色体的的精确位置，以及感兴趣基因是否能够稳定遗传，这为易位系中外源基因的表达和互作研究带来了困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于共线性基因开发标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法，本发明提供的方法能够鉴定大白菜-结球甘蓝易位系中具体导入的外源基因和片段的精确位置，以及感兴趣基因是否能够稳定遗传。

本发明的目的是基于白菜和甘蓝共线性基因差异序列开发相对特异的基因标记，为大白菜和结球甘蓝物种鉴别及大白菜-结球甘蓝易位系的精确鉴定提供新方法，为外源甘蓝基因在大白菜遗传背景下的表达、功能研究及利用甘蓝基因改良大白菜遗传背景奠定基础。

本发明的基本原理是：大白菜与结球甘蓝同属十字花科芸薹属，且都已经完成测序，基于序列的blast发现二者基因组间有较高的同源性，存在很多染色体共线性区段。本发明针对大白菜、结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物，以大白菜、结球甘蓝及其易位系基因组DNA为模板进行PCR扩增，差异位点的不同导致引物的结合效率差异，从而影响PCR扩增效率，通过琼脂糖凝胶电泳检测在供试材料间会表现出PCR产物的有无、带的强弱或位置的差异，若某基因标记在易位系中扩增结果只与大白菜一致，表明该异附加系中没有导入该基因，若某基因标记在易位系中扩增产物只与结球甘蓝一致或同时与大白菜和结球甘蓝相同，表明该易位系中导入了该基因。

本发明的特点是：基于大白菜和结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物，增加扩增效率的差异，提高引物多态性，用于大白菜和结球甘蓝物种的鉴别；标记引物在基因内部设计，可以直接鉴定外源基因的导入；共线性基因在大白菜和结球甘蓝中比例较高，可以开发密度高基因标记，更准确鉴定外源染色体片段的大小。

本发明提供了一种基于共线性基因开发特异标记鉴定大白菜-结球甘蓝易位系的方法，包括：

a)确定大白菜-结球甘蓝易位系中结球甘蓝的基因片段区段；