[发明专利]确定细胞克隆形成能力的方法

说明书

本发明涉及一种确定其中已经插入转基因的主细胞库(MCB)的克隆形成能力的方法。该方法包括测序方法和生物信息学分析的组合，其在源自共同MCB的多个亚克隆上执行，从而在一个参考亚克隆中建立可靠的一组参考转基因插入区域并在源自相同MCB的一个或多个其他亚克隆中建立相应的多组对比性转基因插入区域。基于参考和对比性转基因插入区域之间的一致程度，确定MCB为单克隆或多克隆。

背景技术

重组哺乳动物细胞系是生产治疗性蛋白的有力工具，原因是其能够正确折叠和装配蛋白并且能够向复杂蛋白添加与人类中所发现类似的翻译后修饰。实际上，迄今用于生物药蛋白生产的大部分细胞系都通过各种永生化方式而源自哺乳动物。如今全部重组蛋白药物中约60-70％在哺乳动物细胞中产生。此外，目前还有几百种临床候选的治疗性蛋白正处于公司流水线中。这些蛋白中有许多是在永生化的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达的，但是其他细胞系如衍生自小鼠骨髓瘤的那些(NS0、SP2/0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK-293) 和人视网膜细胞作为制药业中的常规蛋白质生产工具，已经取得监管批准。

在哺乳动物细胞系统中生产蛋白生物药的第一步是产生稳定的单克隆细胞系，在该细胞系的基因组中已经稳定整合了编码目的蛋白的转基因。常使用几种转染方法，如磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质转染胺法(lipofectamine)和病毒转染法，将转基因输送入宿主细胞胞核中进行染色体整合。临床研究中最常使用的一种转染方法是病毒介导的转染，也称作转导。这项技术也已经用来产生生产治疗性蛋白的重组细胞系。病毒介导的转染高度有效并且易于实现持久的转基因表达。一旦DNA进入胞核，转基因整合入宿主细胞基因组，并且它含有的目的基因(GOI)的表达与周围的染色体结构和相关特征部分相关。但是，病毒转染的一个重大缺陷是转基因在宿主细胞基因组的插入不可预测。这种插入的影响是，蛋白质量和数量均变得高度依赖于编码蛋白的转基因的基因组位置。

为了生成产生蛋白的细胞系，将选择标记与GOI一并共转染入宿主细胞基因组。随后通过在适宜的选择培养基中培养，选择阳性转染的细胞。最常见的选择基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)(参与核苷酸代谢的酶)和谷氨酰胺合成酶 (GS)。在这两种情况中，在抑制未转染细胞生长的适宜代谢物不存在的情况下，发生选择。通常，首先根据增殖和蛋白表达筛选已转染的细胞，鉴定出生产潜力和生长特征最好的候选者。在下一个步骤中，分离细胞的汇集物并针对高度特异性生产率的克隆富集。然而，这种汇集物是异质的；它包含在其基因组中具有不同转基因插入位点和拷贝数的细胞，导致蛋白质表达水平不同。

控制从哺乳动物细胞系产生生物产品的关键是表征和检验细胞物质，以确保这些细胞的一致性、纯度及其对生产工艺的适用性。因此，需要分离从单细胞衍生的显示最高蛋白表达水平、增殖速率和最佳产物质量的克隆(ICH Q5D)。为此目的，通过一系列有限稀释步骤或FACS单细胞沉积伴随同步成像和精心筛选，从异质的细胞汇集物回收单细胞，从而分离出少量候选克隆。随后将最有前景的候选者作为初级细胞库(pre-MCB)深冷保存，并评价传代稳定性，后者应当涵盖最长的可能生产期限。除表型稳定性之外，细胞系还需要在不存在选择压力时(通常在生产阶段不施加)接受遗传稳定性评价。一旦鉴定出最佳细胞系，即产生了主细胞库(MCB)。MCB定义为细胞单个汇集物的等分试样，其在限定条件下由所选择的单细胞克隆制备，分装入多个小瓶并储存在限定的条件下(通常-100℃及以下)。商业生产的工艺开发基于这种MCB启动，所述 MCB经扩充以产生工作细胞库(WCB)，后者用于生产工艺。MCB和WCB作为制药业中的生产细胞系的审批取决于对国内和国际卫生当局强制性严格要求的满足。批准重组细胞系作为生产细胞系的重要条件包括确认细胞系的克隆形成能力及检验其微生物污染情况(例如，逆转录病毒或支原体)。