[发明专利]通过在昆虫细胞中扩增遗传密码来制备工程化蛋白质的手段和方法

说明书

本发明涉及制备工程化靶多肽(TP)的方法，所述工程化靶多肽在其氨基酸序列中包含一个或多个相同或不同的非规范氨基酸(ncAA)残基，通过在昆虫细胞系(ICL)中表达所述TP并通过在所述ICL中表达新的正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNA对实现所述方法；适用于将所述正交tRNA合成酶/tRNA的遗传信息引入所述ILC的杆状病毒穿梭载体(杆粒)；用于在所述ILC中表达所述特定tRNA的特定表达盒；由所述方法获得的TP；以及制备所述TP的试剂盒。

技术领域

本发明涉及通过在昆虫细胞系(ICL)中表达工程化靶多肽(TP)并通过在所述ICL中表达新的正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNA对来制备在其氨基酸序列中包含一个或多个相同或不同的非规范氨基酸(ncAA)残基的靶多肽(TP)的方法；适于将所述正交tRNA合成酶/tRNA的遗传信息导入所述ILC的杆状病毒穿梭载体(杆粒)；用于在所述ILC中表达所述特定tRNA的特定表达盒；由所述方法获得的TP；以及用于制备所述TP的试剂盒。

背景技术

非规范氨基酸(ncAA)的掺入是大肠杆菌和真核细胞中蛋白质功能化的主要工具。遗传密码扩增自数十年开始使用，同时在大肠杆菌以及真核系统如哺乳动物(Chatterjee等人，PNAS 2013,110,29：11803-11808)、酵母(Chin,J.W.,Cropp,T.A.,Anderson,J.C.,Mukherji,M.,Zhang,Z.,和Schultz,P.G.(2003)..Science 301,964-967)或黑腹果蝇(Mukai，T等人，Protein Science 2010,19：440-448)中良好建立。该系统用于将非规范氨基酸(ncAA)位点特异性掺入到蛋白质中。应用带有各种官能团的非规范氨基酸的引入，例如，用于单分子研究或超分辨率显微术的蛋白质标记，蛋白质交联或附着选择的翻译后修饰。为此目的，合成酶/tRNA对(其与表达宿主正交)必须与目的蛋白质共转染。合成酶可以响应琥珀终止密码子识别非规范氨基酸，其将被插入延长的蛋白质链中。已经存在若干系统，例如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)TyrRS/tRNA^Tyr或马氏甲烷八叠球菌PylRS/tRNA^Pyl(Liu，C.C.和Schultz，P.G.(2010).Annual review of biochemistry 79,413-444。

琥珀终止密码子UAG已成功用于体外生物合成系统和爪蟾卵母细胞中，以指导非天然氨基酸的掺入。在三种终止密码子中，UAG是大肠杆菌中使用最少的终止密码子。一些大肠杆菌菌株含有天然抑制子tRNA，其识别UAG并插入天然氨基酸。另外，这些琥珀抑制子tRNA已被用于常规蛋白质诱变。

在大肠杆菌中，小和中等大小的蛋白质可以很容易地大量表达。然而，这种简单的实验室宿主不适合表达具有理想的天然真核翻译后蛋白质修饰的大型多蛋白复合物。为了高分子量蛋白质或蛋白质复合物，尤其是源自真核生物的蛋白质复合物的表达，优选其他表达宿主，例如哺乳动物培养物。除了大小限制外，大肠杆菌表达的蛋白质中也不存在大多数翻译后修饰。