[发明专利]用于提供3，4-二羟基苯基化合物及其甲基化变体的生物技术方法

说明书

本发明涉及通过如下获得的经遗传修饰的酶和使用所述酶或其催化活性片段的包括体内和体外方法的生物技术方法：合理设计用于羟基化4‑羟基苯基化合物以产生3，4‑二羟基苯基化合物的原型酶4‑羟基苯乙酸3‑羟化酶(4HPA3H)的活性位点结合口袋。还提供了使用合适的氧化酶或羟化酶的方法，所述方法进一步通过提供合适的O‑甲基转移酶使3，4‑二羟基苯基化合物能够在偶联酶促反应中进行随后的位点特异性甲基化。最后，公开了能够通过上述方法获得的组合物。

技术领域

本发明涉及生物技术方法、通过合理优化用于羟基化4-羟基苯基化合物以产生3，4-二羟基苯基化合物的原型酶4-羟基苯乙酸3-羟化酶(4HPA3H)的活性位点结合口袋而获得的具有优化的底物耐受性和高区域特异性和产物特异性的经遗传修饰的酶或其催化活性片段。进一步提供了使用合适的氧化酶或羟化酶的与上述方法联合的方法，所述方法进一步通过提供合适的O-甲基转移酶使3，4-二羟基苯基化合物能够在偶联酶促反应中进行随后的位点特异性甲基化。提供了用于实施上述方法的合适的核酸和氨基酸序列、载体和重组宿主细胞。最后，提供了可以根据本文中提供的一种方法获得的组合物。

背景技术

3，4-二羟基苯基化合物(例如咖啡酸、白皮杉醇、圣草酚、3，4-二羟基苯甲酸和七叶亭(esculetin))是特别具有抗氧化性质(例如，通过清除有害的氧簇)的珍贵天然产物。包括涵盖抗炎或抗癌活性的多种健康益处的其他有利特性归因于所述类别的化合物。然而，所述物质仅以非常低的浓度存在于适用于食品产品的植物中。这特别适用于存在于柑橘属植物中的圣草酚或其糖苷圣草次苷和新圣草次苷(neoeriocitrin)。圣草酚(参见图1和图13)是一种公知的调味物质，其适用于有效地减少和掩盖各种苦味成分的苦味印象或味道。从现有技术来看，圣草酚的这种性质从EP 1 258 200 B1获知。来源于圣草酚的几种类黄酮在食品和健康工业中也受到极大关注，包括橙皮素、橙皮苷、新橙皮苷、圣草次苷、新圣草次苷和高圣草酚(参见图13)。

与来自天然来源的圣草酚的可用性相比，相关物质柚皮素(参见图1和图13)或其糖苷柚皮苷和柚皮芸香苷可在多种柑橘类物种如葡萄柚或酸橙(枳(Poncirustrifoliata))中以足够的量获得。因此，柚皮素及其相关物质将基本上代表用于获得圣草酚的合适且成本敏感的可替选起始材料。

然而，鉴于化学氧化将仅产生包含圣芳酚的不同氧化产物的混合物，而不是作为唯一的产物，化学氧化不是用于使类黄酮环氧化而没有另外使环体系中的其他位置氧化的副作用的合适的方法。此外，目前还不知晓用于在特定的类黄酮环位置处引入氧化的单步化学氧化方法。另一个问题是所获得的产物的进一步氧化，分别产生圣草酚的醌(chinon)样或更高分子的氧化产物。

因此，对于用于生物技术以产生类似于在通过羟基化作用从柚皮素到圣草酚的典型类黄酮生物合成途径期间发生的天然过程的圣草酚的酶促氧化领域的进步存在持续需求，而这种需求总是涵盖希望提高相应的目标化合物的产率和纯度。

羟基化是使有机分子官能化的一类氧转移反应。羟基通过氢原子的取代或较不常见的另一官能团的取代而引入。尽管这些反应是许多天然产物合成途径的必需部分，但将羟基选择性地引入烷基或特别是芳基部分是合成中最具挑战性的领域之一。因此，直接(芳族)羟基化方法的数量仍是有限的。与这些化学合成方法相比，酶介导的羟基化常常由于高的区域选择性和/或立体选择性而被证明是更有效的，并且越来越受欢迎，同时更环境相容(由于省略了反应性化学物质并且潜在减少有机溶剂)。事实上，生物催化氧化转化已被用于结构不同的化合物的羟基化，包括类固醇、生物碱、萜类化合物或脂肪酸。这些酶促过程几乎仅依赖于细胞色素P450型酶，当然是因为已经重组地产生了大量这些蛋白质。此外，很多细胞色素酶关于底物范围已被充分表征，例如来自巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)及其变体的酶。