[发明专利]用于提供3，4-二羟基苯基化合物及其甲基化变体的生物技术方法

权利要求书

1.催化至少一种4-羟基苯基化合物的生物技术转化以用于产生至少一种3,4-二羟基苯酚化合物的方法，其包括以下步骤：

(i)提供至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列由以下组成：在其活性位点中包含至少一个突变的经遗传修饰的大肠杆菌来源的4-羟基苯乙酸3-羟化酶，其中所述活性位点包含残基I157、M293、Y301和S462，其中所述大肠杆菌来源的4-羟基苯乙酸3-羟化酶为根据SEQID NO:98的相应野生型酶，并且其中所述至少一个突变包括Y301F；

(ii)提供至少一种4-羟基苯基化合物；

(iii)使所述至少一种4-羟基苯基化合物与所述至少一种由经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶组成的氨基酸序列在合适的反应条件下反应，以允许所述至少一种4-羟基苯基化合物通过所述至少一种由经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶组成的氨基酸序列羟基化以产生至少一种3,4-二羟基苯酚化合物；以及

(iv)任选地分离和/或纯化所得的至少一种3,4-二羟基苯酚化合物，

其中所述至少一种4-羟基苯基化合物独立地选自柚皮素、对香豆酸、阿魏酸、白藜芦醇、对羟基苯甲酸、2-羟基咔唑、或伞形酮。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中所述方法作为全细胞方法进行，并且

其中步骤(i)如下进行：

(a1)提供至少一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含以下或由以下组成：经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶；或者包含以下或由以下组成：至少一种编码所述经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶的重组核酸分子；

(b1)任选地：提供至少一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含以下或由以下组成：至少一种包含辅因子再循环酶的氨基酸序列，其中所述至少一种辅因子再循环酶选自黄素还原酶，或至少一种编码黄素还原酶的重组核酸分子；和/或甲酸脱氢酶，或编码所述至少一种甲酸脱氢酶的至少一种重组核酸分子，其中根据步骤(a1)和(b1)的所述至少一种重组宿主细胞是相同或不同的重组宿主细胞，以及

(c1)在合适的反应条件下培养所述至少一种重组宿主细胞，以允许所述至少一种经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶的功能性表达和/或催化活性，以及任选地还允许所述至少一种包含辅因子再循环酶的氨基酸序列的功能性表达和/或催化活性。

3.根据权利要求1所述的方法，

其中所述方法在无细胞体外系统中进行，并且

其中步骤(i)如下进行：

(a2)提供至少一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列由以下组成：在其活性位点中包含至少一个突变的经遗传修饰的大肠杆菌来源的4-羟基苯乙酸3-羟化酶；以及

(b2)任选地提供至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列由以下组成：至少一种辅因子再循环酶，其中所述至少一种辅因子再循环酶选自黄素还原酶和/或甲酸脱氢酶。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其中用于产生至少一种3,4-二羟基苯酚化合物的所述至少一种4-羟基苯基化合物的生物技术转化作为连续流工艺进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种氨基酸序列被提供为固定在合适的载体上。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中用于产生至少一种3,4-二羟基苯酚化合物的所述至少一种4-羟基苯基化合物的生物技术转化作为分批工艺进行。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少一种经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶或者所述编码所述至少一种经遗传修饰的4-羟基苯乙酸3-羟化酶的至少一种重组核酸分子选自SEQ ID NO:44、78、79、141和175；和/或

其中所述至少一种辅因子再循环酶或所述编码所述至少一种辅因子再循环酶的至少一种重组核酸分子选自SEQ ID NO:80至86和176至182。