[发明专利]DNA寡核苷酸的多对组装

说明书

本发明提供了用于多重组装寡核苷酸的方法。

交叉引用

本申请涉及2015年10月1日提交的美国临时专利申请序列号62/235,974，其公开内容通过引用整体并入本文。

关于联邦资助研究的说明

本发明是在美国政府的能源部门-劳伦斯伯克利国家实验室-联合基因组研究所奖金号DE-AC02-05CH11231和国立卫生研究院(NIH)奖金号1R21CA160080下进行的。美国政府对本发明享有一定的权利。

序列表

在此提交的标题为“16-1242-PCT_SequenceListing_ST25.txt”和大小为7kb的序列表通过引用整体并入。

背景技术

传统上，DNA已经通过固相亚磷酰胺化学合成。基于柱的合成产生多达200元(mer)，差错率约为每200个核苷酸1个，且每个产物的收率为10至100nmol。基于柱的DNA合成受限于对384-孔板的通量，并且寡核苷酸取决于长度和收率花费0.05美元至1.00美元/碱基对(bp)。用亚磷酰胺化学(例如Agilent)和基于半导体的电化学酸生产阵列(例如CustomArray)而进行的基于喷墨的核苷酸印刷的商业化，具有增加的通量并降低了寡核苷酸合成的成本。这些寡核苷酸的成本范围取决于长度、规模和平台为0.00001-0.001美元/bp。然而，这些平台受限于合成长度短、合成误差率高、收率低以及从复杂库中组装长构建体的挑战。

近来，许多方法解决了阵列合成的寡核苷酸的高错误率，具有成本和保真度之间的折衷。低成本的方法包括蛋白质，例如MutS、聚合酶和其它结合和切割(cleavage)异源双链体的蛋白质。然而，由于这些方法依赖于识别错配并且要求大部分序列相同，所以它们并不总是与复杂库相容，因此必须在单个基因组装之后进行。此外，由于这些方法保持错误率高达每1000个核苷酸1个，因此需要进一步筛选以确认正确的序列。诸如拨出(Dial-Out)PCR的最近的方法依赖于DNA测序，然后检索序列验证的构建体，实现错误率低至10-7。虽然这些方法可以用于复杂的寡核苷酸池，并且产生非常低的错误率，但是这些方法成本高、时间密集且不总是能回收目标分子。

尽管它们的误差率高，但从微阵列切割的廉价寡核苷酸池最近能够对启动子和增强子功能进行高通量分析，为这些调控元件的词汇提供了新的见解。它们也被用于破译遗传变异体在蛋白质功能中的作用。然而，这些研究都受到合成长度短的限制-CustomArray为约160bp，Agilent为约230bp。

合成长度短和错误率高对使用阵列衍生的寡核苷酸用于功能测定和基因组装表现出瓶颈。本文描述了将数千个阵列衍生的寡核苷酸组装成接近顺式调控元件和蛋白结构域的长度估计值的靶标的方法。与现有方法相比，这里描述的方法不限制使用限制性酶的序列空间，具有高通量，并且提供检索无错组装的有效方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供了用于组装一个或多个双链多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)扩增第一多个单链重叠寡核苷酸，其中所述第一多个单链重叠寡核苷酸包含：(i)能够退火以产生一个或多个双链多核苷酸的具有同源性的重叠区域，和(ii)每个单链重叠寡核苷酸中的至少一个共同引物结合位点；(b)组装一个或多个双链多核苷酸，其中所述组装包括变性、退火和延伸所述第一多个单链重叠寡核苷酸以产生一个或多个双链多核苷酸。