[发明专利]分子质量保证方法在测序中的应用

说明书

本发明涉及用于扩增技术(例如下一代测序技术(NGS))的质量保证方法。

技术领域

本发明涉及质量保证方法。

背景技术

数字单分子基因组测序通常被称为下一代测序技术(NGS)，它通过合成方法进行测序，其与单分子DNA测序相近。NGS方法的一个特点是它们代表在序列中衍生的单个分子。在基于基因组的癌症测定中，NGS用于基因组分析。

然而，NGS的几个方面将从建立等位基因识别(allele calls)的置信度的质量保证过程中受益。这些方面包括对等位基因扩增中生物方面和技术方面偏差的检测、对测序中不良模板或用量不足的模板的检测、对外来的扩增子污染的检测、以及对输入DNA池过程中低发的(lowprevalence)真正的突变的检测。质量保证是临床试验的必要因素，也有助于形成健全的研究基础。

已有几种方法用于对DNA分子进行检测，例如，采用DNA序列的随机连接，其中碱基序列代表一个字符(word)或代码(code)(称为条形码，或分子条形码)，然后进行扩增。

已知的DNA代码方法的局限性在于，它们一般不能对用于检测的有偏差的代码分子集带来的结果进行处理，也不能对依赖于序列的在连接效率上的损失带来的结果进行处理。此外，还需要一些方法来将分子检测与NGS序列的等位基因检测的概率方法结合起来(例如那些采用贝叶斯图形模型的方法，如SNVmix⁽¹⁾，并将其纳入基于特征的序列变异分类器中，如mutationseq⁽²⁾。)

发明内容

一方面，本公开提供了一种确定核酸模板的复杂度的方法，包括以下步骤：

i)提供一个核酸模板；

ii)提供多个引物对，其包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含与所述核酸模板的一部分互补的序列，所述第二引物包含与所述核酸模板的互补序列的一部分互补的序列；

iii)将代码连接到所述第一引物的5’末端、所述第二引物的5’末端或两者之上，以形成代码-引物分子，或将代码连接到所述核酸模板上以形成代码-模板分子；

iv)用所述配对的代码-引物分子和核酸模板，或用所述引物对和代码-模板分子进行确定循环数的扩增反应，以获得扩增反应产物；

v)在每个循环结束时、在确定的循环数结束时、或在任一中间的循环数时，获得扩增反应产物的序列；

vi)在每个循环结束时、在确定的循环数结束时、或在任一中间的循环数时，确定扩增反应产物中每个代码的丰度；

vii)确定每个循环所观测的代码熵(codeword entropy)；以及

viii)将观测的代码熵与估算的代码熵进行比较，以确定核酸模板的复杂度。

另一方面，本公开提供了一种识别真正的序列变体的方法，包括以下步骤：

i)提供一个核酸模板；

ii)提供多个引物对，其包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含与所述核酸模板的一部分互补的序列，所述第二引物包含与所述核酸模板的互补序列的一部分互补的序列。

iii)将代码连接到所述第一引物的5’末端、所述第二引物的5’末端或两者之上，以形成代码-引物分子，或将代码连接到所述核酸模板上，以形成代码-模板分子；

iv)用所述配对的代码-引物分子和核酸模板，或用所述引物对和代码-模板分子进行确定循环数的扩增反应，以获得扩增反应产物；

v)在每个循环结束时、在确定的循环数结束时、或在任一中间的循环数时，获得扩增反应产物的序列；