[发明专利]用于SNP基因分型的方法和装置

说明书

本发明涉及使用侧流试验装置对单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的方法。本发明还涉及包含所述侧流试验装置的试剂盒及其用于对单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的用途。

本发明涉及一种用于单核苷酸多态性(SNP)基因分型的新方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是在同一物种的个体之间的基因组中或同一对染色体之间的单一碱基对变异。SNP占所有人类遗传变异的90％。它们在人类基因组中约每1000个碱基存在一个，并且到目前为止有超过180万个SNP在专门数据库中列出并可用。这些数据库的使用显示，这些SNP不仅可用于法医学目的以鉴别个体，而且可用于诊断或确定某些疾病的易感性，预测病症的严重性或患者对治疗的响应，或确定个体的血型。

有许多方法可用于检测SNP，例如DNA微阵列、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交、DNA测序和单链构象多态性(SSCP)分析、质谱术、引物延伸、限制性片段长度多态性分析和等位基因特异性寡核苷酸连接。然而，这些技术大多昂贵，建立起来复杂，并且不能使用易于使用的过程进行一次性分析。

因此，近年中已开发了新的简化的技术，其中使用简单的试条试验(或侧流测定法)来检测SNP，这允许通过目测检查获得结果(Litos等，2009；Sapountzi等，2015)。这些新技术本质上基于使用目标等位基因特异性引物对靶DNA进行PCR扩增。这意味着所述扩增反应只有在所述引物的3’区与靶序列完全互补时才会发生。因此，用于等位基因的每个特异性引物包含与所述SNP位点相邻的序列和与所述等位基因变体互补的3’核苷酸、间隔臂和5’标志物，所述5’标志物允许它与固定化在所述试条上的探针杂交。Litos等提出了一种可以在同一试条上对几个SNP同时进行基因分型的技术。为此目的，每种等位基因特异性引物包含不同的5’标记物，其将与固定化在所述试条上的探针之一特异性杂交。然而，尽管已取得进展，但这些技术仍然执行起来复杂，特别是因为两个连续的扩增技术(PCR，然后是是引物延伸反应)的使用和/或偶联到待检测的每个等位基因的特异性序列的微球的生产和这些微球在硝酸纤维素膜上的沉积。

发明内容

现在，本发明人显示，可以使用侧流测定装置从单一扩增产物区分同一SNP的不同等位基因变体。

因此，根据第一方面，本发明涉及一种对核酸样品中的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)进行基因分型的体外方法，所述方法包括：

a)扩增含有待基因分型的SNP的所述核酸的一个或多个区域，扩增产物包含能够直接或间接地产生可检测信号的标记物，以及

b)使用侧流测定装置分析在步骤(a)中获得的扩增产物，所述侧流测定装置包含优选地由硝酸纤维素制成的反应区，所述反应区包含固定化在不同位点上的一种或多种核苷酸探针、优选地至少两种核苷酸探针，每种探针具有与待基因分型的SNP的等位基因变体互补的序列，

在所述探针固定化位点处检测到信号指示所述核酸包含所述探针的特异性等位基因变体。

所述扩增优选地通过不对称PCR来进行，更特别优选地通过LATE–PCR来进行。

所述核酸的几个区域的同时扩增可以通过多重PCR来进行。

所述扩增产物可以是5’–标记的，优选地通过在所述扩增期间使用5’–标记的引物进行5’–标记。

所述扩增产物可以用有色、发光、荧光、磷光或放射活性化合物，用酶或配体/抗配体对的第一个成员，优选地用生物素来标记。

优选地，所述可检测信号是肉眼可见的有色信号，并且所述检测通过简单的目测检查来进行。优选地，所述信号通过使用有色粒子例如胶体金粒子来获得。

优选地，在本发明的方法期间使用的侧流测定装置包含：

多孔基质，其包含：

(i)迁移缓冲液施加区，