[发明专利]用于靶向核酸序列覆盖的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月13日提交的美国临时申请No.62/146,834和2015年2月24日提交的美国临时申请No.62/119,996的权益，所述专利在此出于所有目的以引用的方式整体并入。

发明背景

尽管测序技术取得了显著的进步，但人基因组中的约5％至10％保持未装配、未作图，并且不良表征。参考组装序列(reference assembly)通常将这些缺少区域注释为多兆碱基异染色质空位。基因组的此缺少部分包括保持对使用通常所用的测序技术进行精确表征的抗性的结构特征。对整个基因组进行从头测序在经济上是不可行的，因此仍然需要降低与基因组测序相关的成本，同时保留大规模基因组分析的益处。

发明概述

因此，本公开提供了用于提供对基因组的所选区域的靶向覆盖以允许对那些所选区域进行从头序列装配，并且在一些方面允许将从头覆盖与基因组的剩余区域的高通量和高精度的重新测序组合的方法、系统和组合物。

在一些方面，本公开提供了一种对基因组的一个或多个所选部分进行测序的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供起始基因组材料；(b)将单独核酸分子从起始基因组材料分布到离散的分区(partition)中，使得每个离散的分区含有单独核酸分子；(c)扩增该离散分区中的至少一些单独核酸分子的所选部分以形成扩增子群；(d)对该扩增子群进行条形码编码以形成扩增子的多个带条形码的片段，其中给定离散分区中的片段各自包含共同条形码，从而将每个片段与其所来源于的单独核酸分子关联；(e)从多个片段获得序列信息，从而对基因组的一个或多个所选部分进行测序。

在其它实施方案中并且根据上述，该基因组的一个或多个所选部分包含该基因组的高度多态性区域。在其它实施方案中，该基因组的一个或多个所选部分的测序是从头测序。

在其它实施方案中并且根据上述的任一项，扩增包括跨至少3.5兆碱基对(Mb)的区域的PCR扩增。在其它实施方案中，扩增包括利用跨至少3.0Mb的区域交错的多个引物对的PCR扩增。

在一些实施方案中并且根据上述的任一项，测序反应是短读段、高精度的测序反应。在其它实施方案中，在获得步骤中产生的序列信息保留了其来源的单独核酸的分子环境(molecular context)。

在某些实施方案中并根据上述的任一项，在该获得步骤之前，通过以下步骤从该多个片段进一步富集包含基因组的一个或多个所选部分的至少一部分的片段：(i)将与该基因组的一个或多个所选部分中或附近的区域互补的探针与该片段杂交以形成探针-片段复合物；(ii)将探针-片段复合物捕获到固体支撑物的表面。

在一些实施方案中并且根据上述的任一项，离散分区内的扩增子的带条形码的片段代表对基因组的一个或多个所选部分的约100X-5000X的覆盖。在其它实施方案中，离散分区内的扩增子的带条形码的片段代表对基因组的一个或多个所选部分的约200X-1000X的覆盖。在其它实施方案中，离散分区内的扩增子的带条形码的片段代表对基因组的一个或多个所选部分的至少1000X的覆盖。在其它实施方案中，离散分区内的扩增子的带条形码的片段代表对基因组的一个或多个所选部分的至少2000X或5000X的覆盖。

在其它方面，本公开提供了一种从基因组样品的一个或多个不良表征的部分获得序列信息的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)在离散分区中提供基因组样品的单独第一核酸片段分子；(b)将离散分区内的单独第一核酸片段分子片段化以从该单独第一核酸片段分子产生多个第二片段；(c)扩增不良表征的该多个第二片段的所选区域以形成扩增子群；(d)将共同条形码序列附接至每个离散分区内的扩增子，以使得每个扩增子可归属于其所被包含的离散分区；(e)鉴定扩增子的序列，从而从基因组样品的一个或多个不良表征的部分获得序列信息。

在某些实施方案中，并且根据上述的任一项，扩增包括跨至少3.5兆碱基对(Mb)的区域的PCR扩增。在其它实施方案中，扩增包括利用跨至少3.0Mb的区域交错的多个引物对的PCR扩增。在其它实施方案中，多个引物对含有尿嘧啶以防止引物序列扩增。