[发明专利]植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法

说明书

本发明提供一种植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法，其是通过本发明的微电极生物传感器，实现植物体内还原型谷胱甘肽的在线原位活体检测，采用微创方式，对待测目标造成的伤害极小，使得被测目标可继续生长，检测方法可靠，灵敏度高，测定结果准确，并且由于是在体检测，可以减少样本处理时间，避免因处理过程中目标物质的分解、氧化等造成的误差，对还原型谷胱甘肽的生理反应响应灵敏度检测效率高于其他检测方法。

技术领域

本发明涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法。

背景技术

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是广泛分布于植物和微生物细胞内最主要、含量最丰富的含巯基的低分子肽，是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽(L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)，分子式为C₁₀H₁₇O₆SN₃。GSH作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。谷胱甘肽分为氧化型(GSSG)和还原型(GSH)，通常所说的谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽，其半胱氨酸上的巯基是其发挥生物学功能所必需的。还原型谷胱甘肽是植物中含量最丰富的含巯基的低分子肽，为植物机体内的重要活性物质，它参与二硫化物、硫醚和硫酯的形成，并能清除生物体内的自由基，是胞内代谢过程和植物遭受氧化胁迫时所产生的过氧化物的最有效的清除剂之一。植物体内的氧化型谷胱甘肽可以转化为还原型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽含量的比值是反映植物体内谷胱甘肽活性的重要指标，高GSH/GSSG比值则有利于蛋白质的合成。另外还有很多研究表明，GSH是植物体内还原型硫的重要贮藏和运输形式，具有提高植物的抗旱、抗寒性，减轻重金属的毒害等作用。在植物抗逆过程中直接或间接地参与了许多植物的功能活动。

目前植物中测定谷胱甘肽含量的方法很多，如荧光分光光度法、可见分光光度法、紫外分光光度法、碘量法和近些年来发展的HPLC法等，这些方法均是通过对植物组织进行取样，研磨提取后进行检测，属于离体检测技术，获取到的信息也是某一时刻的静态浓度或累积效应，不能反映植物体内还原型谷胱甘肽的瞬时或连续的变化，因此受到技术手段的限制，现阶段针对GSH在植物体内合成、降解、运输的调控机制及对植物抗氧化作用机理等还有很多方面仍不清楚，迫切需要引入新技术和新方法推进研究的深入。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于生物传感技术的植物还原型谷胱甘肽的活体原位在线检测方法，以克服现有技术中需要离体取样，时空分辨率较低，不能实现瞬时和长时间连续监测的缺陷。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种微电极生物传感器，所述微电极的基底电极材料为硅片，硅片上设有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极。

谷胱甘肽氧化酶(glutathione oxidase，GSHOx)可以催化谷胱甘肽生成谷胱甘肽二硫化物(glutathione disulfide)，通过计时电流法记录酶催化谷胱甘肽变化的实时响应。

本发明的微电极可以是贴片式或插入式微电极。

所述微电极为贴片式微电极，表面贴有保护膜；所述贴片式微电极的工作电极为直径5-10mm的金属圆片，参比电极为直径8-16mm的圆环，环宽为2-3mm，长度为3/5整环周长，对电极是与参比电极相同直径和宽度的圆环，长度为1/4整环周长，参比电极和对电极分别呈环形半包围于所述金属圆片的外侧，硅片上设置有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站。所述硅片基底呈薄片状，厚度小于2mm，金属电极片厚度小于1mm。