[发明专利]一种灰楸叶片原生质的制备方法

说明书

本发明涉及一种灰楸叶片原生质体的制备方法，其以灰楸组培苗幼嫩叶片为材料，通过控制纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R‑10的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解温度、酶解时间等因素，获得了灰楸叶片原生质体。本发明所述方法获得的游离原生质体数量多，活力高，可为灰楸原生质体培养及植株再生、遗传转化、体细胞杂交、原生质体融合育种等研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种灰楸叶片原生质体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

灰楸(Catalpa fargesii)为紫葳科(Bignoniaceae)梓树属(Catalpa)高大落叶乔木，是我国传统栽培的优质珍贵用材及园林观赏树种。灰楸根系发达，生长速度快，抗风、固土能力强，耐寒耐旱，材质纹理通直、坚韧致密，是优质速生用材树种。

原生质体是植物细胞去除细胞壁后的产物，可应用于远源亲本间的融合，易于导入外源基因，同时也是研究细胞膜上蛋白质(如离子通道、水孔蛋白、信号受体等)功能的良好材料，并可为细胞间的物质运输，信息交换等的研究提供技术支撑。

目前关于灰楸的研究多集中于遗传多样性评价、优良新品种培育与高效繁育技术研究等方面，有关灰楸原生质体分离和制备方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰楸叶片原生质体的制备方法，该制备方法简单高效，所得原生质体数量多，活性高。

本发明的技术方案为：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体存活率的测定。

本发明提供的制备原生质体的方法，具体包括以下步骤：

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成宽度不超过0.15mm的长条形，置于含1％-3％纤维素酶Onozuka RS和0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10的酶解液中，在摇床上黑暗条件下进行酶解；优选幼嫩叶片用刀片切成1.0mm×0.1mm的长条形；

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液500～700转/min离心3～7min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。

进一步，本发明方法还包括步骤：(4)原生质体的产量用血球计数板测定，重复3次，原生质体产量(个/g)＝酶液中原生质体的数量(个)/酶解所用叶条的质量(g)。

进一步，本发明方法还包括步骤：(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，原生质体存活率＝有活力的原生质体/原生质体总数×100％。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(1)所述的灰楸组培苗高度为6-8cm，选取从上往下第3-6片叶。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液组成：0.01MCaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶Onozuka RS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液配制方法为：纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10、甘露醇在溶液A中充分溶解，50℃加热10min，0.45nm滤膜过滤，静置至室温使用。溶液A的构成为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1。