[发明专利]一种灰楸叶片原生质的制备方法

权利要求书

1.一种灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)样品筛选：取灰楸组培幼苗的幼嫩叶片,其中,所述的灰楸组培苗高度为6-8cm，选取从上往下第3-6片叶;

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成宽度不超过0.15mm的长条形，置于酶解液中，在摇床上黑暗条件下进行酶解，酶解温度25-30℃；其中, 所述的酶解液组成：0.01M CaCl₂，0.02MKCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶OnozukaRS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇;

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液500～700转/min离心3～7min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：(4)原生质体的产量用血球计数板测定，重复3次，原生质体产量＝酶液中原生质体的数量/酶解所用叶条的质量；其中，原生质体产量的单位为个/克，原生质体的数量的单位为个，酶解所用叶条的质量的单位为克。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤：(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，原生质体存活率＝有活力的原生质体/原生质体总数×100％。

4.根据权利要求1所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的酶解时间为6-14h。

5.根据权利要求1所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)幼嫩叶片用刀片切成1.0mm×0.1mm的长条形，所述的摇床转速为50rpm。

6.根据权利要求1所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬。

7.根据权利要求6所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液的配制为：0.01MCaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，0.3-0.7M甘露醇。

8.根据权利要求3所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的0.01％酚藏花红溶液用0.6M甘露醇配制而成。