[发明专利]一种突变TaqDNA聚合酶及其纯化方法

说明书

本发明公开了一种突变Taq DNA聚合酶及其在大肠杆菌中的纯化方法。本发明采用现代基因工程技术，将天然Taq DNA聚合酶进行突变，去除了其5‘‑3’的DNA外切酶活性，并且引入E507R,E742A和A743H（氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定）突变。和野生型Taq DNA聚合酶相比，此突变型Taq DNA聚合酶具有更高的热稳定性和抗生物样品中不纯成分对聚合酶的抑制作用，使其更加适应科研及临床应用需求。其纯化工艺采取简便、快速、高产率的特异性亲和柱，获得的突变型Taq酶质量高、成本低、十分适合工业放大生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种突变型Taq DNA聚合酶及其纯化方法。

背景技术

Taq DNA聚合酶是A. Chien从一种水生栖热菌(Thermus aquaticus) YTI株分离提取的。所述yT1株是一种嗜熟真细菌于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的，适合生长在70-75 ℃生长，。Taq DNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94 KDa, 80 ℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70 ℃延伸率大于60 个核苷酸/秒。TaqDNA聚合酶在95℃酶活性可以持续40分钟，而97.5℃加热5-6分钟可以保持大约50%的酶活。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的自动连续循环的前提条件，也是PCR反应能在生物技术领域迅速发展和广泛应用的原因。

DNA聚合酶作为分子生物学的工具酶，在生物技术和医学临床上的应用十分广泛，具有较高的市场价值。然而随着医药科技的发展，新领域的应用对DNA聚合酶的性能不断提高，原有的野生型Taq DNA聚合酶已经不能满足新的应用要求，如Taq DNA聚合酶容易被血液、粪便中的化学成分所抑制，导致实验或检测的失败。因此需要对野生型Taq DNA聚合酶进行改造和筛选，得到新的突变体来适应科研、医学应用和工业生产的需求。

传统的野生型Taq DNA聚合酶纯化步骤较多，生产过程中所需多步柱上层析，费时长且产率低。1993年Frances c. Lawyer等人采用肝素柱对Taq DNA聚合酶进行亲和纯化，肝素柱虽然特异性比较高，但是载量比较低，不利于放大生产。1994年Harrell和Hart报导的Taq DNA聚合酶纯化方法中提到了用离子交换的方法，1995年Edith Grim报道Taq DNA聚合酶纯化方法中也包含了离子交换的方法。在此以后的大多数关于Taq DNA聚合酶纯化方法的文章中也都采用了离子交换的工艺. 离子交换的工艺虽然能提高载量，但是由于他本身的非特异性洗脱会导致杂蛋白的含量会增多，如果达到一定的纯度要求还需进行其他步骤的纯化，这会增加工艺的复杂度以及提高成本。鉴于此，开发简便、快速、高效、低成本的工业化可行的Taq DNA聚合酶纯化方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法。和野生型Taq DNA聚合酶，对样品中不纯的化学成分具有更强的抗抑制作用。

根据上述目的，本发明提供一种突变型Taq DNA聚合酶，其核苷酸和氨基酸序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。突变的氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定，野生型Taq DNA聚合酶为SEQ ID NO. 3所示。

本发明提供了一种蛋白表达载体，该载体包含了可编码此突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列；此载体可由大肠杆菌表达载体，如pET15b等表达载体经重组得到。

本发明提供了一种大肠杆菌蛋白表达菌株，该菌株包含上述的一种蛋白表达载体可编码上述突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。

上述表达菌株可以为BL21(DE3)等。

本发明还提供了一种上述突变型Taq DNA聚合酶的制备方法, 其包括：