[发明专利]一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法

说明书

本发明公开一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法，包括如下步骤：(1)ELPs介导的C‑intein融合LfcinB重组质粒的构建；(2)以大肠杆菌为宿主制备Titin‑LfcinB、Telethonin‑LfcinB两种融合抗菌肽，混合后制备得到ZT‑LfcinB。本发明将表达、纯化和稳定利用相耦合在一起，使整个小肽从构建在表达载体到体外组装成带有稳定支架的药物，是一个整体流程，较好地克服了某些蛋白质及小肽表达生产和利用效率普遍较低的实际问题。

技术领域

本发明属于生物医药与疾病免疫领域，更具体地讲，涉及一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法。

背景技术

自1940年代发现青霉素以来，抗生素的广泛使用让人们摆脱了细菌性感染带来的恐惧。但随着抗生素的长期使用以及滥用，刺激了病原微生物耐药性的产生。耐药性结核杆菌、MRSA等对人类和动物的危害日趋严重，对社会造成了惨重的经济损失。新型抗生素的筛选进展也因为细菌的耐药性而变得愈加困难。

在合成抗生素发展缓慢的情况下，如何克服因抗生素引起的细菌耐药性问题是当前研究的热点。研究发现，有的生物在受到微生物感染后，会迅速产生一些具有抗菌活性的小分子物质——抗菌肽参与机体免疫。随后科学家们又陆续从植物、微生物、两栖动物、昆虫、哺乳动物乃至人体内鉴定出上千种抗菌肽，说明它几乎是所有生命物种都具有的重要免疫分子。这类抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌细胞等生物活性，从氨基酸组成、合成机制和作用机制等方面都与传统的微生物(细菌、真菌和链霉菌等)产生的抗生素完全不同。因此，抗菌肽作为一种生物来源的、核糖体合成的小分子肽，在新型抗菌剂开发领域具有毋庸置疑的潜在优势，逐渐成为生物医药学科的研究热点[1]。人们积极探索抗菌肽的药用价值，希望开发出替代传统抗生素的新型抗菌剂，为解决病原菌对抗生素逐渐产生的耐药性问题提供新途径。

1972年瑞典科学家Boman H.G.领导的研究小组，通过将大肠杆菌注射到惜古比天蚕蛹中，在诱导的天蚕免疫血淋巴中发现并提纯得到了抗菌肽P9A和P9B。通过氨基酸序列测序分析，确定了此类抗菌肽的一级结构，并将之命名为天蚕素(cecropins)，这也是人类发现并得到的第一个抗菌肽。

抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMPs)由10～50个氨基酸构成，是生物先天性非特异性防御系统的重要组成部分。AMPs具有广谱抗菌活性、高效性、稳定性等特点，对细菌、真菌甚至是艾滋病病毒和癌细胞也具有很强的抑制作用。此外，由于它们的作用靶点主要位于微生物的细胞膜上，诱导微生物细胞膜去极化，导致细胞破裂，因此，不易引起微生物抗性突变产生，是替代传统抗生素的有力候选者之一。

目前，人们主要通过三种方法获得目的抗菌肽:(1)生物提取，(2)化学合成，(3)利用基因工程手段表达，它们各有优缺点。

(1)生物提取的抗菌肽

生物体内诱导产生抗菌肽，其缺点是含量低、难度大、效率低、对技术和成本要求高，难以实现规模化生产，且对于一些高等生物和人源抗菌肽的生产来说也不现实。

(2)化学合成的抗菌肽

随着对多肽和蛋白质化学结构的进一步深入研究和多肽合成技术的诞生，人工合成活性肽的方法为抗菌肽的研究提供了很大便利。许多研究结果表明，化学合成的AMPs表现出与天然AMPs相同的生物学活性，但化学合成方法同样面临着成本高昂的问题，限制了抗菌肽的广泛应用。

(3)基因工程表达的抗菌肽

对大量抗菌肽分子结构的分析和比较后人们发现，计算机辅助设计新型抗菌肽并利用基因工程技术制备是新药开发的一个重要手段。抗菌肽分子量小，化学结构简单，抗菌谱广，无抗生素抗性，免疫反应性低，便于合成，这些优点有利于人们利用计算机软件对抗菌机理进行测试分析和修饰改造。