[发明专利]一种大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法和功能验证

说明书

本发明公开了一种大豆耐低磷基因Gm100776332及其克隆方法和应用，属于资源与环境技术领域。本发明通过差异蛋白质组学探索大豆基因组中糖酵解途径的相关基因，在低磷条件处理下，运用qPCR技术测定华春5号和瓦窑黄豆的表达量进行测定。运用差异蛋白组学和q PCR技术最终筛选到了差异明显的Gm100776332基因，克隆了大豆耐逆基因Gm100776332，并通过转化拟南芥对其耐低磷的关键性指标‑可溶性糖含量进行测定。

技术领域

本发明属于资源与环境技术领域，具体涉及一种大豆耐低磷基因Gm100776332克隆方法和功能验证。

背景技术

大豆起源于我国，是我国的第四大粮食作物之一，富含脂肪和蛋白质。作为传统的粮、油、饲料作物，在农业生产中具有非常重要的地位。磷素是植物生长发育和新陈代谢所必需的营养元素，它以多种方式参与植物体内的各种生物化学过程。但，土壤中大部分磷很难被植物吸收、利用。华南地区多为酸性红壤，pH值低，磷很容易被固定，有效磷更是严重缺乏，导致该地区大豆产量较低、经济效益很难满足人们的生产需求，从而使土壤缺磷成为华南大豆生产的最重要的限制因子之一。通过增施磷肥，可提高土壤中有效磷的含量，但由于磷肥在土壤中扩散速度慢，导致磷素利用率非常低，而且大量施用磷肥也会带来水体和土壤污染。

随着分子生物学和分子遗传学的发展，植物耐逆方面的研究取得了长足的进展。在分子水平上逐步地揭示耐逆的本质成为研究者的目标，因此，利用蛋白质组学研究，解析与大豆耐低磷相关的分子机制，发掘耐低磷基因，以实现大豆对磷素的高效利用，这对改善南方的大豆产量具有重要的现实意义和应用前景。本研究在实验室前期研究的基础上，解析了大豆耐低磷基因Gm100776332的相关功能，挖掘到了耐低磷基因，对今后的大豆遗传改良奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于利用蛋白质组学探索大豆耐低磷的相关基因，首先对实验室现有的耐低磷和磷敏感型大豆品种进行低磷处理、筛选，最后确定华春5号为耐低磷大豆品种，瓦窑黄豆为磷敏感型大豆品种。最后运用iTRAQ技术和qPCR技术挖掘耐逆基因，最终将该基因转化到拟南芥中，最终得到了耐低磷基因。

在低磷处理48h后，对华春5号和瓦窑黄豆分别提取蛋白进行iTRAQ分析和qPCR测定，发现在糖酵解途径发生了较为明显的差异。发现在该途径中丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase，PDC)表达量发生了明显的变化，进而也引起了本研究的关注。丙酮酸脱羧酶是一种以焦磷酸硫胺素为辅酶的羧基裂解酶，在植物中广泛存在。作为发酵途径中的关键酶，PDC催化糖酵解所产生的丙酮酸脱羧生成乙醛。PDC驱动发酵代谢通路，通过与PDC竞争代谢丙酮酸参与植物体内的能量代谢和物质代谢，响应缺氧、低温、高盐等多种生物与非生物胁迫。本研究通过对该基因的克隆、功能验证，发现该基因对低磷环境具有一定的抵抗能力。最终确定了该基因Gm100776332在大豆的耐低磷途径中起着一定的作用，提供一种大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法。本发明的另一目的在于提供上述克隆方法获得的大豆耐低磷基因Gm100776332。

本发明的另一目的在于提供上述基因Gm100776332的应用；所述的应用为大豆耐低磷基因Gm100776332的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法：应用引物F：5-ggatccATGAACACTAACATCCTCGGCG-3；引物R：5-ggtaccTCACTGAGGATTGGGAGGACG-3进行反转录PCR，94℃3min预变性，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环后72℃再延伸10min；对大豆华春5号在无磷条件下处理48h中克隆了Gm100776332基因，长度为2303bp，包含277bp的5’非翻译区，214bp的3’非翻译区和1812bp的开放式阅读框。

一种大豆耐低磷基因Gm100776332由上述克隆方法获得，其核苷酸基因序列如下所示：