[发明专利]一种大豆耐低磷基因Gm100776332的克隆方法和功能验证

权利要求书

1.一种大豆耐低磷基因Gm100776332在参与耐低磷途径中的应用，其特征在于：

所述的大豆耐低磷基因Gm100776332的核苷酸基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在参与耐低磷途径中的应用，其特征在于：通过采用转基因拟南芥来实现权利要求1中大豆耐低磷基因Gm100776332调节的应用。

3.根据权利要求2所述的大豆耐低磷基因Gm100776332在参与耐低磷途径中的应用，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）大豆耐逆基因的发掘：

华春5号大豆种子表面消毒，将消毒过的种子种于石英砂中，发芽后待幼苗长出真叶时，选择长势一致的幼苗移至含不同磷浓度1/2 Hoagland营养液中继续培养；然后将植株转至无磷的液体培养液中处理48 h时，取2 cm左右的大豆根尖；提取蛋白质，通过iTRAQ检测及数据分析，以及利用qPCR方法进一步验证，qPCR与iTRAQ技术获得相同的结果，均发现PDC在各个时间点的表达量都发生明显的变化，通过NCBI找到该基因，命名为Gm100776332；

（2）大豆Gm100776332基因的克隆：

取iTRAQ测定的同一批大豆根尖材料，然后用TRIzol提取法进行RNA的提取并反转录成cDNA，克隆出了Gm100776332的CDS序列，CDS序列长度为1812 bp；测序后进行比对，Gm100776332的序列和William 82参考序列一致，连接pZeroBack/Blunt vector载体进行测序，鉴定正确后转化农杆菌中；

（3）拟南芥为载体来实现大豆耐逆基因Gm100776332参与耐低磷调节试验：

首先进行拟南芥的遗传转化，Gm100776332基因转化拟南芥阳性植株的筛选，转拟南芥耐低磷的基因时间点qPCR验证；为了进一步了解Gm100776332的功能，构建过量表达载体对拟南芥进行异源转化，得到的T0代种子经含有20 mg/L潮霉素的筛选培养基中培养，10天后把具有抗性的苗移入营养土中；得到T1代后，取以上20株T1代植株叶片提取基因组总DNA，用质粒DNA作阳性对照，野生型植株DNA和水作阴性对照，扩增潮霉素基因，初步证明目的基因Gm1007763321已整合在拟南芥的基因组中；同时进行野生型拟南芥和转基因拟南芥植株可溶性糖含量的测定，转基因拟南芥的表达量较野生型有了明显的提高，通过此次实验，推测该基因可能参与大豆耐低磷机制。