[发明专利]一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法

说明书

本发明提供了一种检测血吸虫DNA的方法，将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增得到扩增产物，用荧光探针法对扩增产物进行实时检测；所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；所述等温扩增的温度为35～45℃；所述等温扩增的时间为5～20min；本发明提供的方法不依赖热循环仪，操作简单，能够在较低的温度(35～45℃)下对血吸虫DNA进行检测，并且扩增所用时间短(5～20min)，适合基层和现场检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法。

背景技术

日本血吸虫病是世界性分布的人兽共患寄生虫病，是世界卫生组织(WHO)界定的“六大热带病之一”，也是我国五大寄生虫病之一。日本血吸虫病是由尾蚴感染接触疫水的人和动物等终宿主引起的。幼虫在终宿主体内通过吸收宿主营养发育，造成宿主营养不良；通过转变抗原、抗原伪装和减弱宿主的免疫力等途径来抵抗宿主免疫的杀伤作用，逐渐发育至成虫，寄生于门脉-肠系膜静脉系统。急性期症状表现为发热、肝肿大、腹痛、腹泻和便血等；慢性期症状主要表现为肝脾肿大或慢性腹泻；晚期，主要与肝脏门静脉周围纤维化有关，临床表现为巨脾、腹水等。

日本血吸虫(Schistosomajaponicum)属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、裂体属、日本种，雌雄异体。雄虫平均长13mm，雌虫平均长15mm。虫卵圆形，淡黄色，卵壳薄，无盖，在其侧方有一小刺，成熟的卵内含毛蚴。毛蚴呈长椭圆形，卵内毛蚴在水中孵出，侵入钉螺，钉螺是其唯一的中间宿主，所以日本血吸虫病的流行地理分布和钉螺的地理分布相一致，有一定的地方性。血吸虫的基因组由8对染色体组成，其中7对为常染色体，1对性染色体。

在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫，我国血吸虫病主要分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广西、广东、福建等12个省的433个县(市、区)，共有钉螺面积148亿平方米，累计感染者达1160万例，受威胁人口在1亿以上。我国的血吸虫病经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已得到有效控制，但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大，一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散明显，新钉螺区出现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，我国的血吸虫病防治工作还任重道远。

在血吸虫病的防控中，诊断与检测工作显得更为重要，它为防治活动的计划、实施和防治效果评价等个环节提供必要的信息和科学依据。用于血吸虫诊断的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和超声诊断等，但是传统的血吸虫检测方法检测周期长、漏检率高、程序复杂、检测结果滞后，已经远远不能满足现代的检测要求。近年来，随着科学技术的发展，特别是分子生物学的不断发展，国内外研究学者已经建立了较多快速、灵敏以核酸为基础的血吸虫检测方法，目前已有多种日本血吸虫的核酸诊断方法包括PCR，Q-PCR以及LAMP等检测方法。PCR及Q-PCR法依赖于热循环仪器，对操作环境及人员有较高的要求，并且耗时长，而LAMP法的问题在于扩增产物对环境的污染，会导致假阳性的出现，对操作环境及操作技巧的要求更高，这些方法不适合在基层单位和现场检测中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、耗时短、易于检测结果的低温血吸虫DNA检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测血吸虫DNA的方法，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；