[发明专利]一种荧光探针检测血吸虫DNA的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的荧光探针检测血吸虫DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：将扩增体系与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测，有荧光信号放大为阳性，说明存在血吸虫DNA；所述扩增体系包括以下组分：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、单链结合蛋白、重组酶、UvsY蛋白、核酸外切酶、荧光探针、DNA聚合酶和血吸虫DNA特异性引物；

所述血吸虫DNA特异性引物由正向引物和反向引物组成：

正向引物序列：

5'-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3'，

反向引物序列：

5'-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3'；

所述荧光探针序列为：

5'-CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3'

所述等温扩增的温度为35~45℃；

所述等温扩增的时间为5~20min；

所述扩增体系包括以下浓度的组分：Tris缓冲液30~50mM、醋酸钾50~150mM、醋酸镁8~30mM、二硫苏糖醇4~9mM、质量浓度为5.5~7.8%的聚乙二醇、ATP 1~6mM、dNTPs 0.1~0.4mM、磷酸肌酸20~100ug/μL、单链结合蛋白300~1000ng/μL 、重组酶50~500ng/μL 、UvsY蛋白50~200ng/μL 、核酸外切酶30~200ng/μL 、荧光探针50~150nM、DNA聚合酶60~150ng/μL 、正向引物200~600nM和反向引物200~600nM；

所述扩增体系为冷冻干燥后的粉末状扩增体系，用终浓度为6%(w/v)，分子量为35000的聚乙二醇溶液作为缓冲溶液将所述扩增体系重新溶解后与血吸虫DNA混合，进行等温扩增；

所述血吸虫DNA的体积为0.5~1.5μL ，浓度为10~100ng/μL 。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增体系的体积为25~100μL 。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等温扩增在恒温条件下进行，所述等温扩增的温度为37~42℃。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述等温扩增的时间为10~20min。

5.一种检测血吸虫DNA用等温扩增体系，其特征在于，包括以下含量的组分：Tris缓冲液30~50mM、醋酸钾50~150mM、醋酸镁8~30mM、二硫苏糖醇4~9mM、质量浓度为5.5~7.8%的聚乙二醇、ATP 1~6mM、dNTPs 0.1~0.4mM、磷酸肌酸20~100ug/μL、单链结合蛋白300~1000ng/μL 、重组酶50~500ng/μL 、UvsY蛋白50~200ng/μL 、核酸外切酶30~200ng/μL 、荧光探针50~150nM、DNA聚合酶60~150ng/μL 、正向引物200~600nM和反向引物200~600nM；

所述正向引物序列：

5'-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3'，

所述反向引物序列：

5'-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3'；

所述荧光探针序列为：

5'-CATAGGAGGTCATCTTGTTCAAGGTCAAGTCTCACCATCAACTCTTA-3'。