[发明专利]小鼠ECM的制备方法及得到的不同来源的小鼠ECM和小鼠卵巢体内再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程及医学再生领域，尤其是小鼠ECM的制备方法及得到不同来源的小鼠ECM和小鼠卵巢体内再生的方法。

背景技术

卵巢疾病是目前困扰女性的一大难题，但目前的治疗都会对卵巢造成一定的损伤。2008年，心脏移植的成功再生开启了ECM支架的研究热潮。研究表明生物支架在物种间具有良好的保守性，并能很好的被异种宿主接受，在一定程度上降低了免疫排斥反应。此外，天然的三维支架也能够影响细胞的有丝分裂、细胞的分化，同时也含有利于细胞募集、增殖和分化的生长因子，促进组织结构的修复和重建。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种小鼠ECM的制备方法及得到不同来源的小鼠ECM和小鼠卵巢体内再生的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种小鼠ECM的制备方法，包括以下步骤：

(1)取出小鼠的不同组织，将其置于不同浓度的洗涤剂中，处理不同的时间，然后使用灭菌水和PBS清洗洗涤剂，保证ECM中不含有洗涤剂；

(2)对制备的ECM进行组织学分析和生化分析，优选出最好的小鼠ECM。

所述步骤(1)中洗涤剂为SDS和Triton中的一种或两种组合。

优选,所述组织为小鼠卵巢组织。

所述步骤(2)包括对ECM的组织切片进行H&E和DAPI染色，并对ECM的弹性蛋白、胶原和sGAG三种成分含量的测定以及残留DNA量对比分析。

上述的小鼠ECM的制备方法制得不同来源的小鼠ECM。

一种小鼠卵巢体内再生的方法，将获得的小鼠ECM，移植回小鼠卵巢原位，不同时间点取出ECM，观察其再生情况，并且对再生卵巢从再生效率、组织学分析、免疫组织化学分析、基因表达情况和生殖能力检测五方面进行分析鉴定。

所述小鼠ECM移植回小鼠卵巢原位的方法：腹腔注射麻醉受体小鼠，用手术剪刀在背中线中部开口，用镊子在背侧将肌肉层扎破并伸入到体腔内，夹出与卵巢相连的脂肪组织，撕破卵巢包膜，夹取出卵巢，将制备好的ECM重新放回到卵巢包膜中，将其放回到体内，缝合伤口，做好标记。

所述再生效率＝回收再生卵巢数量/移植小鼠卵巢数量×100％，计算再生效率；所述的组织学分析使用常规H&E染色的方法。

所述免疫组织化学分析包括使用脱蜡、脱水、微波加热抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、AP显色、复染、脱水、透明、封片、镜检。

所述基因表达情况采用PCR和qPCR两种实验方法验证不同基因的表达情况；所述生殖能力检测包括雌雄小鼠比例为2：1合笼，检查阴栓，观察其生仔情况。

本发明的有益效果是：首次成功的再生出小鼠卵巢，并且在移植四周后配对能够成功的产生后代，进一步为解决女性因卵巢功能停止造成的不孕症提供了新的方法，为人类生殖做出新的贡献。同时，脱细胞处理后的组织也在再生医学的领域中具有更广阔的应用前景。本发明的方法简便，成本低廉，实验条件要求低，可操作性强。

附图说明

图1为本发明处理后的ECM与再生的卵巢形态学和组织学对比照片。

图2为不同基因的免疫组织化学表达情况照片。

图3为不同基因在移植后不同时间的表达情况图。

具体实施方式

以下是对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明提供小鼠ECM的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：收集小鼠卵巢或其他组织器官，分别采用不同的洗涤剂，用不同的浓度处理不同的时间，制备小鼠ECM。

步骤二：使用无菌水和1xPBS清洗残留的洗涤剂，两种清洗液各洗八次，每两小时换一次液，最后在PBS中加入双抗，4℃备用。

步骤三：对制备的ECM进行组织学分析和生化分析确定最佳处理条件。

所述洗涤剂为SDS和Triton中的一种或两种组合。

所述不同的浓度洗涤剂和不同的处理时间是根据不同的组织来确定最佳的处理条件，例如卵巢组织的ECM使用的洗涤剂为(质量体积百分比，克每毫升)1％、0.5％、0.2％的SDS，处理时间分别为6h、12h、20h。

所述的ECM的组织学分析是固定不同浓度、不同时间处理的ECM，制作石蜡组织切片，分别用H&E和DAPI染色方法对组织切片进行染色，根据染色结果初步鉴定ECM内的细胞是否去除干净。