[发明专利]一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，步骤为：海带雌配子体细胞的转化；重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达；重组玉米蛋白z108β的提取和纯化。本发明首次通过海带配子体细胞的大量培养获得纯度达到99.9％的重组玉米蛋白，重组玉米蛋白z108β在海带配子体细胞的表达，使得海带雌配子体细胞成为一种可以生产生物农药的生物反应器，本发明在水生植物中表达陆生植物的重组蛋白，而且大规模培养条件下分裂的雌配子体细胞具有目标基因的遗传稳定性。

技术领域

本发明涉及一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，具体涉及通过基因转化的方法将玉米蛋白的基因z108β在海带雌配子体内表达，通过蛋白纯化和提取，获得具有应用价值的重组玉米蛋白z108β。

背景技术

重组玉米蛋白是一种II型核糖体失活蛋白(RIP)，是植物体内一种抑制异源生物体活性的防卫蛋白，其主要功能表现在水解后的蛋白RIP具有两个肽链——α肽和β肽，其中α肽具有N-糖苷酶活性，而β肽具有类凝聚素的Lectin活性。α肽可以专一切割核糖体28RrRNA 4324的腺苷，阻遏延伸因子EF-2与核糖体的结合，从而抑制外源生物有机体的蛋白合成。从玉米胚芽中获得的z108基因经过重组以后，在大肠杆菌表达的重组蛋白对于黄曲霉(A.flavus)等多种植物病原菌具有抑制孢子萌发的作用，是一种具有抗菌特点的防卫蛋白；而它的β肽链能够独立地与细胞表面的糖元或半乳糖结合，抑制甜菜夜蛾(S.exigua)等害虫的取食，表现出一种抑制鳞翅目昆虫生长的作用。

发明人在过去的研究中已经将玉米的核糖体失活蛋白基因z108转移到大肠杆菌BL21中，在实验室条件下提取、纯化并获得重组的抗菌蛋白。2010年获得了一项发明专利(一种玉米抗菌蛋白的基因及其编码蛋白的应用ZL200810014139.6)。海带(L.japonica)属于褐藻门，是多年生的大型藻类，烟台市及其周边沿海的海带养殖面积达15多万亩，年产鲜海带150多万吨，占全国的80％。海带中含有多种药用活性成分，如岩藻聚糖硫酸酯——一种对巨噬细胞、T细胞有直接作用的抗癌药物。用充气悬浮培养的海带雌配子体细胞，生长极快，生物量可每周翻一番，一个月的生物量可提高20倍。重组玉米蛋白z108β基因在海带雌配子体上表达并实施大规模的细胞培养，是以玉米蛋白抗虫功能表达作为一种廉价的生物反应器合成生物农药。

发明内容

本发明将重组玉米蛋白基因z108β在海带雌配子体内表达，并进行大规模的细胞培养，有助于利用海带作为海洋生物反应器来生产重组玉米蛋白。

重组玉米蛋白z108β是一个长度为375bp，共有124个氨基酸的小的肽链，重组玉米蛋白z108β的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。重组的玉米蛋白z108β是一个构建在重组质粒pBA002载体中的转化载体pBA002-z108β，其转化的作用就是将z108β基因整合到海带的基因组中，并且让海带种苗在海水的生长中表达这样一个基因，产生这样一个蛋白。

转化载体pBA002-z108β的构建：载体质粒pBA002用XbaI/SacI双酶切，与pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因(经过XbaI/SacI双酶切)连接，其连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，获得重组质粒载体pBA002-z108β，-70℃保存。

本发明中基因转化的方法使用的是基因枪轰击技术，通过金粒击打海带配子体细胞的细胞膜，让重组质粒载体携带重组玉米蛋白的基因整合到海带染色体的基因组中，并获得遗传上稳定的表达。该发明是用基因枪以金粒轰击海带配子体的方法再加入质粒共培养可以获得更多的雌配子体转化细胞，通过基因检测也能够大幅度提高海带雌配子体细胞的转化率。

本发明的技术方案如下：

一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，具体步骤如下：

(1)海带雌配子体细胞的转化