[发明专利]一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）海带雌配子体细胞的转化

包括如下步骤：

①生长中的海带雌配子体细胞品系13号的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的海带雌配子体细胞团，细胞密度为5×10⁵-2×10⁶个/mL，转化时用60mm的无菌培养皿，将雌雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm的圆形轰击圈；

②用试剂盒提取质粒pBA002-z108β的DNA，用以轰击后的共培养和基因转化；

③对海带雌配子体细胞团进行轰击：打开PDS-1000\He型基因枪电源，打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi，即1500psi；挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；

④向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是11-13℃，光照为800Lux，共培养48小时；

⑤在草丁膦40mg/L的浓度下筛选转化的雌配子体细胞；

（2）重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达

转化后的雌配子体细胞培养28-35d，挑取克隆单独培养，将海带配子体均匀涂布在带有滤纸的培养皿中，在解剖镜下用毛细管挑取褐色的转化体，加入培养液大量培养，培养海带雌配子体细胞的营养液为：灭菌海水中添加浓度为10.0g/L的NaNO₃和浓度为1.0g/L的KH₂PO₄，其中，NaNO₃溶液的添加量为每升海水添加1.0-10.0mL；KH₂PO₄溶液的添加量为每升海水添加0.4-1mL，并且每天更换一次营养液，培养温度是11-13℃，每天为光照培养14小时、暗培养10小时，光照为800Lux；将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养5-10d；

（3）重组玉米蛋白z108β的提取和纯化

包括如下步骤：

①海带雌配子体转化体细胞的破碎和分离

取0.1g转化培养后的海带配子体转化体样品放入液氮中研磨，加入1×样品缓冲液200μL，混合后煮沸5min，12000rpm离心10min；

②提取上清液并利用SDS-PAGE电泳鉴定

取20μL上清液，用于点样检验；SDS-PAGE电泳采用10%的分离胶和积层胶；

蛋白样品上样，每孔20μL，80V电压下电泳30分钟后电压120V电泳60-80分钟；

③重组玉米蛋白z108β的蛋白印迹法验证和纯化

海带雌配子体细胞转化体的验证使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行PVDF转膜，电流90mA，转膜100min，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的去离子水中，漂洗1分钟，以洗去膜上的转膜液，放入封闭液中，摇床上封闭2小时；清洗后将膜浸于稀释好的一抗中，37℃孵育1-2h；用10mLTBST洗膜3次；再将膜浸于稀释好的二抗中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色拍照；

获得的重组玉米蛋白用8kD的再生棉绒纤维素透析膜透析除盐，并12000rpm离心20分钟收集沉淀；

④重组蛋白的浓缩和保藏

将离心纯化的蛋白集中收集，离心纯化后的重组玉米蛋白z108β在-20℃条件下保存；

所述的1×样品缓冲液的配方为：1.0 M tris-HCL pH 6.8 1mL，10% SDS 6.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，ddH₂O 2.8mL；

所述的10%的分离胶的配方为：去离子水 9.9mL，30%丙烯酰胺 8.3mL，Tris-HCL pH8.8 6.3mL，10% SDS 0.25 mL，10% 过硫酸铵 0.25mL，TEMED 0.01mL；

所述的积层胶的配方为：无离子水 5.5mL，30%丙烯酰胺 3.5mL，Tris-HCL pH 8.81.5mL，10% SDS 0.08mL，10%过硫酸铵0.08mL，TEMED 0.008mL；

所述的一抗是由新西兰大白兔的z108抗血清与5%脱脂奶粉按比例1：1000混合而成；

所述的二抗是由HRP标记的羊抗兔IgG与5%脱脂奶粉按比例1：2000混合而成；

所述的重组玉米蛋白z108β的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。