[发明专利]一种用于植物基因组定点碱基替换的载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于植物基因组定点碱基替换的载体以及植物基因组定点碱基替换的方法。

背景技术

锌指核酸技术(Zinc finger nuclease，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcription activator-like(TAL)effector nucleases，Talen)和CRISPR/Cas9技术是这几年基因组编辑领域的几项突破性技术^1-3。这三种技术都可以在生物体基因组指定位点特异性的切割DNA产生双链断裂，从而利用生物的非同源末端连接或同源重组，进行定点编辑。ZFN和Talen技术用特异性的蛋白引导，蛋白元件的构建相对较复杂，编辑效率有待提高。CRISPR/Cas9技术以RNA引导，体外构建简单，编辑效率较高。目前，这三种技术已成功的应用于多种生物，包括大肠杆菌、酵母、水稻、拟南芥、大豆、玉米、小鼠和人类细胞等⁴。

基因组编辑技术在生物体基因组的指定位点引入双链断裂后，其编辑的结果都是随机的碱基插入或缺失(Indel)⁴。到目前为止，在植物基因组中进行精确的碱基替换一直是一项难题，其实现途径主要是同源重组，即通过外源供体DNA来实现碱基替换，但是其效率非常低，至今还尚未有效应用于植物研究和育种。现有的几个发表在国际顶级期刊的碱基替换的报道都还只是瞬时表达实验^5，6，或者其编辑位点本身就是筛选标签⁷，例如除草剂双草醚的靶基因乙酸乳酸合成酶ALS等⁸。另一方面，大规模的基因测序表明，重要的农艺性状位点大多都是单碱基改变^9，10。因此，在植物研究和育种领域，迫切需要一种能够进行高效的碱基替换的方法。

因此，本领域迫切需要在植物领域建立一套适用于植物细胞的高效的定点碱基替换工具，并且可获得稳定植株，从而有效的应用于植物研究和育种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于植物细胞的高效的定点碱基替换工具，并且可获得稳定植株，从而有效的应用于植物研究和育种。

本发明第一方面提供了一种用于对植物进行基因编辑的核酸构建物，所述的核酸构建物包括：

第一表达盒；

第二表达盒；和

任选的第三表达盒；

其中，所述第一表达盒为用于表达gRNA的gRNA表达盒；

所述第二表达盒为用于表达融合蛋白的融合蛋白表达盒，所述的融合蛋白具有式Ia或Ib结构：

A-L1-B-L2-C(Ia)

B-L1-A-L2-C(Ia)

各式中，

A为胞嘧啶脱氨基酶；

L1为无或第一连接肽(如Xten)

B为无切割活性的Cas9或仅具有单链切割活性的Cas9；

L2为无或第二连接肽(如Xten)；

C为无或Uracil DNA glycosylase inhibitor(UGI)；

所述第三表达盒为用于表达筛选标记的筛选标记表达盒；

并且，所述的第一表达盒、第二表达盒、和第三表达盒各自独立地位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一表达盒具有式A结构：

X1-X2-X3(A)

式中，

X1为植物启动子，优选植物聚合酶III驱动的启动子(如U6、U3启动子)；

X2为gRNA的编码序列；

X3为polyT。

在另一优选例中，所述的第二表达盒具有式B结构：

Y1-Y2-Y3(B)

式中，

Y1为植物启动子，优选UBI、CaMV35S、Actin启动子；

Y2为融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白具有如上所述的式Ia或Ib结构；

Y3为终止子。

在另一优选例中，所述的第三表达盒具有式C结构：

Z1-Z2-Z3(C)

式中，

Z1为植物启动子，优选35S、UBI、Actin启动子；

Z2为编码筛选标记的编码序列；

Z3为终止子。