[发明专利]无血清细胞培养基及高效表达重组蛋白质的方法

说明书

本发明提供一种用于CHO细胞培养的无血清细胞培养基，所述培养基由基础培养基和补充培养基组成，基础培养基中添加胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷及腺苷，补充培养基中添加精氨酸、苯丙氨酸及甲硫氨酸。使用所述无血清培养基培养CHO细胞，使其高效表达CD47/PD‑L1双功能融合蛋白，经本发明所述的培养方法培养获得的CD47/PD‑L1双功能融合蛋白，糖型修饰以G0F为主。

技术领域

本申请是申请日为2016年12月09日，申请号为CN2016111298564，发明名称为“无血清细胞培养基及高效表达重组蛋白质的方法”中国申请的分案申请。本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及无血清细胞培养基及高效表达重组合蛋白的方法。

背景技术

现代医药行业中，用重组技术制备生产蛋白质已经发展为标准化方式，通过克隆编码各蛋白的基因、用该待表达的基因转化适宜的表达宿主、最后产生和纯化所获得的重组蛋白质。其蛋白质包含单克隆抗体、细胞因子、融合蛋白等，此类蛋白质多用于治疗肿瘤、自身免疫疾病、炎性障碍、免疫抑制等多种医学领域。

蛋白质类药物的应用，需要以工业化大规模生产来提供大量的重组蛋白质。优选的表达系统是哺乳动物细胞，其优于大多数其它基于昆虫细胞、酵母等的真核表达系统，或传统的原核表达系统。

在工业化大规模生产蛋白质时，细胞培养的条件是影响产量的关键因素，因此，对于细胞培养的培养基配方，及培养条件的确定至关重要。

血清补充动物细胞培养基通常能提高细胞活力以及重组蛋白质的产量，但在过去近20年中，逐渐发现含有血清的培养基所获得的基因重组蛋白质，会存在外源因子污染的风险。血清是未表征的物质的混合物，其可能随批次变化。而且来自动物或人来源的血清或其他补充物还有外源因子污染的风险，例如支原体、朊病毒和病毒污染。

为了克服与血清有关的病原性污染的风险，过去已经开发了无血清培养基。无血清培养基通常补充有血清替代物，如生长因子、细胞因子、白蛋白、胰岛素和转帖蛋白。这些蛋白通常分离自动物来源，因此，培养基受病原体污染的潜在风险依然存在。例如，利用分离自动物或人来源的牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）或转铁蛋白可便于细胞培养（US6733746）。这种方法仍然存在向细胞培养物中引入外来病原体的危险，例如，来自HAS的HIV、克雅氏病因子（Creutzfeld Jakob agent）或肝炎病毒的风险。病原体污染的风险不利于培养基在动物和人治疗剂的生产中的应用。已经公开了包含重组白蛋白和另外的源自动物成分的培养基（WO2008009642）和含有重组白蛋白和重组胰岛素的培养基（US20060115901）。

出于调节和安全的考虑以及关于采购，在蛋白质的商业生产中消除血清（Grillberger等人，Biotechnol. J. 2009,4,186-201）然而，在无血清培养基中生长的动物细胞对营养缺乏可能十分敏感，且营养缺乏可诱导细胞凋亡。细胞凋亡不利地影响重组蛋白质的质量和滴度（Franek和Eussenegger，2005，Biotechnol. Prig. 21,96-98）。从大豆和小麦等植物蛋白的水解产物中，获得添加在无血清培养基中的细胞所需的营养成分。Franek等人从植物蛋白质水解制备无血清培养基中的植物蛋白添加剂，并且测试了它们支持鼠杂交瘤细胞的生长和分泌的能力（Franek等人，2000，Biotechnol. Prog. 16,688-692）。

靶向CD47与PD-L1的双功能抗体融合蛋白（简称双功能抗体融合蛋白）是一种双特异性免疫检查点药物（属于一种特殊类型的双特异性抗体）（专利申请号2016103729544）。该蛋白包括二硫键链接的两个部分，一部分由SIRPα（CD47的配体）突变体和抗体的Fc段（IgG1型）融合而成，能与CD47结合；另一部分由抗PD-L1抗体的轻链和重链（IgG1型）组成，能与PD-L1结合（结构见图1）。此双功能抗体融合蛋白与一般抗体结构差异较大，因此在培养条件上与常规抗体也有所不同。因此需要开发针对此融合蛋白的个性化培养基来提高其蛋白表达量。