[发明专利]一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法

说明书

本发明公开了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，该方法利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸及其盐，采用固液双相酶解与超滤系统联用的方法制得高浓度透明质酸酶解液，进而通过灭活、活性炭吸附除杂、过滤、喷雾干燥得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。本发明所得产品稳定性好、分子量超低，抗炎、透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强，具有皮肤细胞损伤修复等优点，可广泛应用在化妆品、食品及医药领域。该方法工艺流程操作简单，条件温和，不使用各种醇，能耗相对较低，对产品结构无破坏，无环境污染，适合大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种酶切法制备透明质酸寡糖及其盐的工艺，特别是涉及一种固液双相酶解与超滤联用制备具有超低分子量的透明质酸寡糖及其盐的方法，属于透明质酸技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10⁵~10⁷Da（道尔顿）。寡聚透明质酸是指分子量小于10kDa的透明质酸，而超低分子量透明质酸寡糖主要是指分子量≤3kDa的透明质酸盐。

不同分子量的透明质酸表现出不同的生物活性，低分子量透明质酸甚至表现出与高分子量透明质酸完全相反的活性。很多文献都对透明质酸在创伤修复中发挥的作用进行了报道，尤其是低分子量及透明质酸寡糖作为活性物质受到更多关注。

有研究认为，当透明质酸的分子量降低至寡糖的水平时（10kDa以下），透明质酸寡糖能够抑制细胞炎性因子的产生，防止创伤愈合过程中产生过度的炎症反应（Kim M Y,Muto J, Gallo R L. Hyaluronic Acid Oligosaccharides Suppress TLR3-DependentCytokine Expression in a TLR4-Dependent Manner[J]. Plos One, 2013, 8(8):65-65）。也有文献报道，对于由人体皮肤对正常的外部环境刺激产生过度的炎症反应引起的红斑痤疮，透明质酸寡糖能够抑制皮肤产生抗菌肽，减轻炎症反应（Lee H, Lee S. 263Hyaluronic acid oligosaccharides suppress cytokine expression induced bycathelicidine peptides[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2016, 136(9):S206-S206）。

目前，分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖通常采用生物酶解法进行降解得到，而物理法或化学法降解无法获得超低分子量透明质酸寡糖。酶解法降解透明质酸具有只断裂单糖分子间的糖苷键、不会对结构造成破坏、反应条件温和、制备的透明质酸寡糖不会发生褐变、不会造成环境污染的优点。但是，随着降解所得的透明质酸的分子量的降低，降解过程所需的酶量会越来越多，酶解法制备透明质酸寡糖需要的酶量远远大于制备低分子量透明质酸所需要的酶量，而商品化的透明质酸酶价格高昂，因此一直无法进行大规模工业化生产制备透明质酸寡糖。

此外，透明质酸作为高分子多糖，其溶液黏度随着分子量、浓度的升高而升高，在酶解过程中，透明质酸加入酶解液中容易形成外部液体内部固体的包块，透明质酸分散过程耗时耗力。同时，高浓度透明质酸溶液会形成一种致密的弹性体，阻碍透明质酸酶与透明质酸的构象转变，影响底物透明质酸与透明质酸酶活性中心的结合，降低酶解速率，需要加入更多的透明质酸酶才能将高分子透明质酸降解至目标分子量。

发明内容