[发明专利]一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法

权利要求书

1.一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）酶解缓冲液准备：调节纯化水pH为4~9、温度为20~48℃，然后加入芽孢杆菌透明质酸酶，配成酶解缓冲液；

（2）固液双相酶解：在搅拌下向酶解缓冲液中加入氧化锆分散珠，再快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在搅拌下酶解至至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系后，再次快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀形成透明质酸-酶解液固液双相酶解体系，继续搅拌酶解，直至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系；

（3）超滤：酶解体系变为液液单相酶解体系时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，直至酶解反应液中的透明质酸或其盐的分子量≤3kDa，控制超滤条件使酶解结束时超滤滤出的清液体积为酶解反应液的40-60%；

（4）后处理：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，进行灭活、活性炭吸附、过滤处理，过滤所得滤液进行喷雾干燥，得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述芽孢杆菌透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵得到；酶解液中芽孢杆菌透明质酸酶的用量与步骤（2）中加入的高分子量的透明质酸或其盐固体的总质量的关系为：每1kg高分子量的透明质酸或其盐固体需要4×10⁵~1×10⁶IU的芽孢杆菌透明质酸酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量大于10kDa；所述高分子量的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量为100kDa~1000kDa。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，在30-40rmp的搅拌速度下加入高分子量的透明质酸及其盐固体，加入后再在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌速度调整为15-20rpm，进行固液双相酶解；当超滤与酶解反应液连接后，酶解搅拌速度调整为80-100rpm。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征是：步骤（2）中，每次加入高分子量的透明质酸及其盐固体时，加入时间控制在5-15min内。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，每次加入的高分子量的透明质酸及其盐固体在体系中的质量体积浓度为10~18%；步骤（3）中，超滤系统中的超滤膜的截留分子量为3kDa。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，酶解温度为20~48℃，酶解pH为4-9。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是：步骤（2）中，酶解温度为30~45℃，酶解pH为5.5~7.5。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，由固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系所需的酶解时间为0.5-2h；超滤与酶解联合的酶解时间为1-6h。