[发明专利]一种检测MTHFR基因rs1801131多态位点基因型的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测MTHFR基因rs1801131多态位点基因型的方法及试剂盒。本发明在基于PCR‑RFLP法检测MTHFR基因rs1801131多态位点基因型的过程中，选用了一种低成本的内切酶，同时了引入了特有的“内部质控”机制，即在PCR产物中引入内对照酶切位点，可根据酶切图谱识别酶切不完全的情形，并且能够排除残留PCR产物或酶切中间产物的干扰，根据特征条带准确判断基因型，极大地提高了检测结果的准确性。

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种检测MTHFR基因rs1801131多态位点基因型的方法及试剂盒。

背景技术

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶【5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR】是叶酸代谢系统中的关键酶，其编码基因的某些多态性可导致酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，从而引发多种疾病，涉及(1)妇幼保健类：神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病，自发性流产；(2)肿瘤类：肺癌、胃癌、大肠癌等；(3)高血压、冠心病、脑梗塞、脑溢血；(4)精神类疾病等。

MTHFR基因rs1801131单核苷酸多态位点(相关序列数据见图1)系开放读码框第1286位碱基发生A→C的突变【A1286C，文献旧称A1298C，对应于GenBank中mRNA序列NM_005957.4的1515位碱基或基因组序列NG_013351.1的16685位碱基)，导致多肽链第429位的谷氨酸变为丙氨酸(NP_005948.3:p.Glu429Ala】，携带MTHFR 1286C等位基因的酶活性为野生型的68％左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。检测该位点基因型，可指导孕妇合理补充叶酸，预测唇腭裂、唐氏综合症、神经管缺陷等新生儿出生缺陷；还可作为5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗疗效和毒副作用的良好预测指标；还可提示脑卒中、冠心病和静脉血栓的高风险性等。

目前，检测MTHFR基因rs1801131位点基因型的方法有PCR-RFLP、Sanger双脱氧链终止法测序、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、荧光定量PCR、焦磷酸测序、基因芯片、高分辨率熔解曲线法(HRM)等，除PCR-RFLP法外，其他方法均需昂贵设备或试剂，操作相对繁琐，检测周期长，检测成本高，部分方法还存在结果不稳定、重复性差等缺点。相反，PCR-RFLP法操作简单，对仪器设备要求低，便于应用，但文献报道该位点大多采用限制性核酸内切酶MboII进行检测，存在一定的弊端，因为多态位点临近的一个MboII识别序列有可能导致分型错误，详见文献【Allen RA,Gatalica Z,Knezetic J,Hatcher L,Vogel JS,DunnST.A common 1317TC polymorphism in MTHFR can lead to erroneous 1298ACgenotyping by PCR-RE and TaqMan probe assays[J].Genet Test,2007,11(2):167-173.】的具体分析(图2)。

此外，也有使用Fnu4HI、AjuI来检测该位点的【相关文献分别为下述(1)、(2)】，它们均为稀有的限制性核酸内切酶，价格昂贵，760元/20次酶切反应(见Thermo Scientific公司官网报价)；另外，PCR产物中不含内对照酶切位点，酶切不完全时残留的PCR产物可能会导致基因型误判。比如在AjuI酶切方法中，PCR产物为189bp，A等位基因酶切完全后将产生147bp、32bp、10bp片段，C等位基因无切割位点，将保持和PCR产物一样大小(189bp)的片段。如果一个AA型的样品酶切不完全，既有147、32bp条带，又残留189bp片段，将很可能会被误判为AC型样品。