[发明专利]用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了用于检测COX‑1、COX‑2和GPIIIa基因多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测COX‑1、COX‑2和GPIIIa基因多态性的检测方法。其检测结果为阿司匹林抵抗提供指导性意义。本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异(包括置换、颠换、缺失和插入)形成的遗传标记，相比微卫星分子标记，其数量多，多态性丰富。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物敏感度或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

随着我国人口老龄化，心脑血管病发病率逐年攀升，心脑血管疾病早已成为人类健康的第一大杀手，心脑血管疾病的高致死率、致残率和复发率已造成了极大的社会负担和经济负担。抗血小板药物(尤其是阿司匹林)在心脑血管病的防治中起着至关重要的作用，但是目前的调查结果表明很多心脑血管病患者即使服用了抗血小板药物，仍然反复再发卒中，这种现象称为抗血小板药物抵抗。

抗血小板药物抵抗与诸多因素相关，如心脑血管病的相关危险因素(糖尿病、代谢综合征、急性冠脉综合征疾病等)，患者依从性或药物剂量，药物相互作用及基因多态性等。其中基因多态性因素是目前研究热点。阿司匹林在体内主要是通过与内皮细胞环氧酶(Cyclooxygenase，COX)的结合使其失活，从而抑制血栓素A2(TXA2)和前列环素(PGI2)的产生，达到抗血小板的作用。既往研究发现，在体内影响阿司匹林作用的多个环节因子存在基因多态性，这种多态性直接影响其功能，从而使得不同个体服用阿司匹林后，对血小板的反应不同。据不完全统计，临床阿司匹林抵抗的患者高达40％。阿司匹林作为缺血性脑血管疾病二级预防的重要药物，尽快明确阿司匹林抵抗相关基因多态性至关重要。

COX有两种同工酶，即COX-1和COX-2。COX-l主要在成熟血小板表达，阿司匹林通过乙酰化COX-1活性位点530位的丝氨酸，不可逆抑制COX-1的活性，从而阻断血栓素A2(TXA2)介导的血小板活化，用于预防血栓性血管事件的发生。研究发现COX-1常见的4个多态性位点与阿司匹林抵抗的关系，发现SNP中A842G与阿司匹林抵抗有关，在用AA诱导测血小板聚集率时，阿司匹林抵抗患者中携带G等位基因的频率，要远高于阿司匹林敏感者，用PFA-100测血小板功能时，携带G等位基因的患者，有着更短的闭孔时间。COX-2为诱导型酶，生理情况下，在大多数组织和细胞中检测不到，离体情况下，许多刺激物，如生长因子、炎性细胞因子肿瘤诱导剂等可刺激细胞的COX-2表达。COX-2在动脉粥样斑块中表达，阿司匹林剂量需要达到抑制COX-1剂量的170倍，才能阻断COX-2，小剂量阿司匹林不能完全抑制COX-2诱导的TXA2生成，也是阿司匹林抵抗的原因之一。COX-2基因启动子-765G＞C多态位点研究表明GC杂合基因携带者与GG纯合基因携带者相比较，前者对阿司匹林药效不敏感的概率是后者的3.872倍。