[发明专利]利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA分子标记技术领域，具体涉及一种利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法。

背景技术

微卫星（microsatellites）或称简单重复序列（simple sequence repeats, SSR）是指由1-6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列，几乎存在于迄今研究过的所有生物当中，并且分布密度很大。因微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来广泛应用的DNA标记，常应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。

在自然环境中，紫背浮萍基本以无性生殖进行繁殖，当环境条件适宜时2天即可克隆出一代，种群遗传多样性水平较低。

现有技术提供多种卫星标记的检测方法，例如，中国发明授权专利文献 一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法 授权公告号 CN 103305611 B该发明涉及一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法，包括 ： （1）锈斑蟳基因组 DNA 的提取 ； （2）根据 GeneBank 数据库中锈斑蟳的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列 ； （3）微卫星标记引物的设计 ； （4）锈斑蟳不同个体的基因组 DNA的 PCR 扩增 ； （5）PCR 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该发明的检测方法具有快速、准确、灵敏等优点，能够直观地检测出锈斑蟳不同个体的基因型，从而快速获得锈斑蟳在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，该微卫星标记可应用于锈斑蟳遗传变异与种群遗传多样性分析等领域，但微卫星标记检测速度还有提升空间。

发明内容

本发明针对上述技术问题提供一种紫背浮萍Sp10微卫星DNA标记的检测方法，可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。

本发明针对上述技术问题所采取的方案为：利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：

1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；

2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e 1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；

3）设计特异性引物：

微卫星点Sp10特异性引物：F: CCATCTGTCGTCCTTTTTCCC

R: CGCCCCATCACTTATTTCGTA；

4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；

5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。

可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。

步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天，通过人工驯养的方式使野生状态下的紫背浮萍以无性繁殖的方式进行繁殖，获得较多的样品。

步骤2 DNA提取法为改良的CTAB法，通过对CTAB法进行改良，获得的DNA质量优异，提取过程中无明显的DNA降解。

步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min轻轻颠倒混匀，使样品充分溶解在提取液中，通过颠倒混匀提高提取效果。

步骤2中h将沉淀物用65~75%乙醇漂洗，离心，弃上清液，通过乙醇漂洗使核酸充分的分离出来。

步骤2中j提取产物取2~3μl用1.0~2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于‐10~-30℃保存备用，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。