[发明专利]检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法

说明书

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特征在于：包括获得突变体植株、恢复其矮小皱缩表型、反转录后得cDNA和RT‑PCR检测步骤。本发明中的方法能快速检测油菜素内酯主要合成基因突变体的突变体位点。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种油菜素内酯生物合成基因DWF5突变体的筛选方法。

背景技术

植物激素在植物细胞内产生的一类极低浓度的活性物质。它们在植物细胞生长分裂、组织器官的分化、开花结实、成熟与衰老、种子休眠与萌发及环境适应与抵抗等方面起着不可或缺的作用，调节着植物生长发育与环境适应的各个方面。近年来，人们通过外源施加生长激素来调控农作物使其高产、高抗、优质获得了重要进展。目前，人们了解和应用得最多的几大类激素包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸等。这几大类植物激素都是简单小分子化合物，但其生理效应却十分重要复杂。其中，油菜素内酯发现得较晚，但已广泛应用于作物叶片大小、产量、株高和抗性调节。作为一种甾醇类物质，油菜素内酯作用于植物生长发育和环境适应的各个方面。因此，研究油菜素内酯对于农作物株型调节、高产、高抗等方面具有重要的理论价值和实用意义。

油菜素内酯合成或信号缺失突变体表现出典型的矮小、黑暗中去黄化、推迟开花、雄性不育、根短小等表型(Clouse and Sasse 1998)。突变体的发现加快了油菜素内酯的作用机理研究和广泛应用。自从油菜素内酯受体BRI 1通过诱变获得该基因突变体后，大量BRI 1弱缺失突变体被发现，它们表现出半矮小表型，与强突变体最大的优势是具有可育性，方便进行遗传操作(Li and Chory 1997；Noguchi et al.1999)。比如，bri 1-5是最早发现的bri 1弱突变体，通过甲烷磺酸乙酯(EMS)诱变而得，在油菜素内酯机理研究中应用得最为广泛的弱突变体之一。bri 1-5是BRI 1蛋白胞外结构域半胱氨酸对中第69位氨基酸由酪氨酸取代半胱氨酸而导致(Noguchi et al.1999)。此外，bri1-6、bri1-7、bri1-8、bri1-9是另外几个通过EMS诱变导致氨基酸替换而得的bri1弱突变体(Noguchi etal.1999)。bri1-6是第644位甘氨酸突变成天冬氨酸而致，bri1-7是第613位甘氨酸突变成丝氨酸而致，bri1-8是第983位精氨酸突变成天冬酰胺而致，bri1-9是第622位丝氨酸突变成苯丙氨酸所致。bri1-301是一个由于第989位甘氨酸突变成异亮氨酸而成(Xu etal.2008)。bri1-120是由于第339位丝氨酸突变成苯丙氨酸而致(Shang et al.2011)。

在过去二十年中，科学家们借助模式植物拟南芥中bri 1相关突变体发现了大量BR合成和信号途径中的新成员。例如，用遗传方法筛选bri 1-5的遗传抑制子发现了油菜素内酯信号转导途径中的重要成员BRS1、BAK1、BRL1、BSU1(Li et al.2001；Li et al.2002；Mora-García et al.2004；Zhou et al.2004)。bes1-D作为bri1-119的遗传抑制子被发现(Yin et al.2002)，atbs-D是在br1-301背景下被发现(Wang et al.2009；Kang etal.2010)。通过对bri1-5的遗传抑制子的筛选，人们获得了调控油菜素内酯合成关键限速酶的转录因子TCP1(Guo et al.2010)，以及发现了油菜素内酯分解代谢途径中的关键酶BEN1(Yuan et al.2007)。