[发明专利]检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法

权利要求书

1.检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获得检测样品植物；将T-DNA pBIB-BASTA用根癌农杆菌介导的方法转化进入拟南芥Col-0，获得转基因样品植株；

(2)用1μM油菜素内酯喷施样品植物，恢复其矮小皱缩表型；表型为发育迟缓、莲座宽度变小、植株高度降低、荚果长度减小；

(3)按照Qiangen公司生产的RNA提取试剂盒及说明书提取总RNA，取2μg总RNA用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶按照其说明书进行反转录后得到cDNA；

(4)RT-PCR检测，取100ng总RNA对应的cDNA，用宝生物生产的ExTaq酶按照其说明书进行PCR扩增；若发现油菜素内酯合成途径中关键基因未表达，则为存在突变体；其中所述关键基因为dwf5，未表达的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特征在于：所述检测方法中包括步骤：提取检测样品植物的基因组DNA，用引物P1和P2扩增得到DNA片段，发现DNA片段长度减小，经测序鉴定后发现检测样品植物中缺失一段DNA序列。

3.根据权利要求2中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特征在于：所述引物P1序列为：5’-CATAAAATGGGAGATTGGGAGT-3’

引物P2序列为：5’-CATAGGTGCAACACTTAATCCA-3’。

4.根据权利要求1所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特征在于：所述PCR扩增条件如下：95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min，第2至第4步重复29个循环；72℃延伸10min。

5.根据权利要求1中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法，其特点在于：所述PCR扩增中引物序列如下：

DWF5-F：5’-ATGACTCGAGCTCTGCTGCTG-3’；

DWF5-R：5’-TCATACGTATATCCCTAAAAC-3’；

以EF1a为内参基因，EF1ɑ-F：5’-CAGGCTGATTGTGCTGTCCT-3’；

EF1ɑ-R：5’-TCAAGTAGCAAAATCACGGCGCTT-3’。