[发明专利]一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法

说明书

本发明公开了一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，属于微生物技术领域。该方法主要包括细菌分离培养、革兰氏染色及镜检和生化鉴定试验三步操作，方法简单、耗时短，成本低，鉴定结果准确、可靠。其中细菌分离培养依次采用营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基进行选择性培养，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离。

技术领域

本发明涉及一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，属于微生物技术领域。

背景技术

大肠杆菌是一类广泛存在于自然界并能引起人和动物共同感染的人畜共患病病原，依其致病机制可分为3类：共生型、肠内致病型和肠外致病型。大肠杆菌病主要是由病原大肠埃希氏菌引起的一种急性、多形性、肠道型传染病。在兽医临床上，由于病源性大肠杆菌的血清型、免疫状态、生理机能以及猪的日龄等存在差异，常见的猪大肠杆菌病分为3种，即3日龄仔猪黄痢、7～10日龄仔猪白痢和30日龄仔猪水肿病。猪大肠杆菌病在世界各地均有发生，而仔猪黄、白痢是猪场中最为常见的传染病，其发病率、死亡率均居仔猪疫病之首，已给养猪业带来极大危害和严重的经济损失。大肠杆菌病发生后多采用抗生素类药物进行治疗，但是由于抗生素的广泛及不合理使用，细菌耐药性问题日益严重，特别是多重耐药性问题更加突出。为防治该病，国内外已研制出多种类型的基因工程菌苗和多价灭火菌苗，但由于大肠杆菌的血清型复杂及各地区流行菌株的不同，免疫效果尚不甚理想，一般以自制的灭火菌苗效果为佳。

为了解和掌握各地区大肠杆菌的耐药程度，并为临床上有效防治药物的筛选提供依据，有必要对采集样本中致病性大肠杆菌进行生化和血清型鉴定。而一般性鉴定程序为：分离培养→挑取可疑菌落→纯培养→革兰氏染色、镜检→生化试验。鉴定步骤为：将病料用生理盐水稀释，并接种于普通培养基上，37℃恒温培养18～24h，观察细菌生长情况和菌落特征，挑取单菌落接种于麦康凯琼脂平板上，37℃恒温培养18～24h后，再挑取红色、中等大小的光滑菌落进行革兰氏染色、镜检，染色情况、形态和大小等均符合大肠杆菌特征的菌株初步判定为大肠杆菌，挑取疑似菌株进行吲哚试验、MR试验、VP试验、H₂S试验、三糖铁试验和糖发酵试验，结合生化试验结果最终判定菌株属种。但是该方法的鉴定结果尚不够准确，尤其是分离纯化操作中菌落形态模糊，不利于挑取分离。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，该方法采用营养肉汤培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基分离纯化病料菌株，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离，操作简便，鉴定结果准确、可靠，误差小。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)细菌分离培养：将采集的样品接种于营养肉汤培养基中，培养后取菌液划线接种于麦康凯琼脂培养基上，观察菌落生长情况，挑取单个或成对的红色菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基上，观察菌落生长情况，挑取单个或成对的紫黑色菌落备用；

2)革兰氏染色、镜检；

3)生化鉴定试验；

步骤1)中营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7～8g，牛肉膏2～2.5g，氯化钠3.5～4g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨12～18g，牛胆盐3.5～4g，氯化钠3.5～4g，琼脂10～15g，乳糖7～8g，中性红0.01～0.03g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨7.5～8.5g，乳糖7～8g，磷酸氢二钾1.2～1.8g，琼脂15～20g，2％伊红水溶液12～18mL，0.5％美蓝水溶液10～15mL，蒸馏水750mL，pH值7.2～7.4。