[发明专利]制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法

说明书

本发明涉及一种重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株制备L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的方法。重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏号为：CCTCC M 2016496，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明采用基因重组和定点突变技术，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株。以发酵所得菌体细胞为生物催化剂，在柠檬酸三钠缓冲液体系中，以蔗糖和L‑抗坏血酸为原料制备AA‑2G。本发明直接采用蔗糖为糖基供体，原料易溶于水，而且价廉易得。同时产物单一，反应产物主要为AA‑2G，收率高达65%，不需额外添加糖化酶处理，生产成本低。

（一）技术领域

本发明涉及生物催化剂制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的技术领域，具体涉及一种制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法。

（二）背景技术

L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷,即2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbid acid，AA-2G），是由日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系年共同发现的一种的L-抗坏血酸（即维生素C）的葡萄糖苷衍生物（J. Biochem. 107,222-227 (1990)；Agric. Biol. Chem., 54 (7),1697-1703（1990）；US5084563（1992））。它具有抗坏血酸的生理活性，同时由于L-抗坏血酸的2位C上的羟基以α-1，4糖苷键与葡萄糖相连接形成稳定的稳定的糖苷键，显著降低L-抗坏血酸的还原性，稳定性大大提高。目前，AA-2G主要应用于化妆品行业，具有抗UV、抑制黑色素等美白功效作用。

日本学者最早发现AA-2G时，是采用来源于根霉属或毛霉属的a-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，α-Glucosidase）作为催化剂剂，但是AA-2G产物浓度极低，后来发现使用源自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC2.4.1.19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，简称CGTase）作为催化剂，以环糊精和L-抗坏血酸为原料制备AA-2G，转化率提高至45%（Agric. Biol. Chem., 55 (7), 1751-1756, 1991）。后来陆续报道一些其他糖基转移酶也能以相应糖基供体（如麦芽糖、低聚糊精、淀粉等）和L-抗坏血酸及钠盐为原料来生物催化合成AA-2G。所以，目前所报道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20，α-Glucosidase）（US3763009（1973））、环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC 2.4.1.19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，简称CGTase）（US5084563（1992）、US5137723（1992）、和US5407812（1995）、US9265781B2（2016））、α-淀粉酶（EC 3.2.1.1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylas）（Biotechnol Lett 29:611–615，2007）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.5，Dextransucrase）（Microbiological Research 165：384-391，2010）、α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶（US20060216792（2006）、US8759030（2014）和CN201510179664（2015））等6类酶。

目前AA-2G工业化生产上采用CGTase为生物催化剂，但是采用路线还存在以下不足之处：

一是生产所用的CGTase酶为商业化酶制剂，而不是采用最为直接的CGTase发酵液或者含CGTase酶 的菌体细胞，究其原因是目前CGTase发酵酶活力普遍不高，酶活力低无法满足制备AA-2G的酶活要求；另外，若采用CGTase发酵液或菌体为催化剂，则需要经菌体破碎、浓缩等操作步骤达到制备AA-2G的酶活要求。

二是除生成目标产物AA-2G外，还会生成一系列的二糖、三糖、四糖以及五糖等多糖基衍生物，还需额外添加a-糖化酶进行水解多糖基衍生物转化成目标产物AA-2G，增加工艺步骤。