[发明专利]检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因的方法、引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测白血病二氢叶酸还原酶融合 基因的方法、引物及试剂盒。

背景技术

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，由于克隆的白血病细胞在 骨髓和其它造血组织中大量增殖累积，使正常造血功能受到抑制，同时浸 润其它组织和器官。白血病主要表现有白血病细胞的增生与浸润。非特异 性病变则为出血及组织营养不良和坏死、继发感染等。白血病细胞的增生 和浸润主要发生在骨髓及其他造血组织中，也可出现在全身其它组织中， 致使正常的红系细胞、巨核系细胞显著减少。骨髓中可因某些白血病细胞 增生明显活跃或极度活跃，而呈灰红色或黄绿色。淋巴组织也可被白血病 细胞浸润，后期则淋巴结肿大，部分白血病患者有明显中枢神经系统白血 病改变，或者为血管内白细胞郁滞、血管周围白细胞增生。最易发生白血 病浸润的脏器是肾、肺、心脏及胸腺、睾丸等，临床表现为贫血、出血、 感染以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。

既往细胞形态学分型的诊断符合率及正确率受检测者主观成分影响较 大，近两年白血病分子特征的研究取得了明显进展，尤其是对染色体易位 形成融合基因，有一些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标 志和确定诊断的唯一依据，通过对白血病相关融合基因进行检测，不仅可 以为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，同时也是白 血病微小残留病的检测基础。融合基因的检测对白血病的诊断意义重大， 能评价白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的诊断分型更加科 学化和规范化；可检出1×10⁶个有核细胞中的一个白血病细胞，在白血病 的早期诊断方面有着其它方法无可比拟的特异性和敏感性。细胞遗传学分 型与疾病的预后关系密切，因此融合基因的检测对于指导临床个性化治疗 方案的选择和判断预后具有十分重要的意义，初治时可指导科学合理选择 长期治疗方案，避免不必要的治疗不足或过度治疗。

甲氨蝶呤是临床上治疗各型急性白血病，尤其是急性淋巴细胞性白血 病常用到的抗肿瘤药物。甲氨蝶呤作为一种叶酸还原酶抑制剂，主要抑制 二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使 嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基团的转移作用受阻，导 致DNA的生物合成受到抑制，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。该药选 择性地作用于细胞分裂的S期。

DHFR是甲氨蝶呤作用的靶目标，甲氨蝶呤抗肿瘤作用的基本原理是 竞争性结合DHFR，使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸。研究表明，DHFR 基因突变所导致DHFR构型改变，致使其与甲氨蝶呤结合的亲和力减弱， 这可能是DHFR相关的甲氨蝶呤治疗疗效和耐药的重要原因。基因变异的 不同导致肿瘤治疗反应的不同，这提示DHFR基因的检测可作为白血病治 疗监测和随访的指标。我们新近的研究显示，白血病患者中DHFR-Chr7融 合基因的检出预示着甲氨蝶呤化疗药物疗效不佳或者容易耐药，宜选用其 它药物治疗。

融合基因检测常用的方法主要包括白血病细胞染色体核型分析、染色 体荧光原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。在实际操作中，染 色体核型分析常常受到检测技术条件和人为操作因素的影响，荧光原位杂 交技术结果较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费 时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读也存在较大的 主观性，因而一定程度上限制了这些方法的应用。而聚合酶链式反应(PCR) 技术中常见的实时荧光定量PCR方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交 法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI染料法中使用的SYBR GreenI 由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过 观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重复性好、高通量、灵敏、准确 和快速的筛选治疗白血病的药物的方法和系统，本发明还提供了用于该方 法和系统的重复性好、特异性好、灵敏度高、检测效率高和适用范围广的 引物对和探针组合，以及含有该引物对和探针组合的试剂盒及其应用。